李正義，賈俊濤*，姜英輝，王 駿，羅 繼，崔淑華，徐 彪，梁成珠，張鐵軍

(1．山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，山東青島266002;2．AB SCIEX公司上海應用實驗室，上海200233)

麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii)是國際公認的11種致病性弧菌之一，也是引起感染性腹瀉的致病菌［1］，主要能引起人類的創(chuàng)傷性感染和敗血癥［2］。目前對于麥氏弧菌檢測方法的研究主要集中在傳統(tǒng)的分離鑒定和分子生物學技術(shù)等方面［3］，而對提取的麥氏弧菌蛋白進行系統(tǒng)分析目前未見報道。國內(nèi)外研究人員主要采用二維電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrum，MALDI-TOF MS)技術(shù)對細菌提取蛋白的酶解產(chǎn)物進行分析［4－5］。Khot等利用 MALDI-TOF MS技術(shù)采集志賀氏菌屬和大腸桿菌的蛋白質(zhì)種屬生物標記物，得到15個屬標記物和12個種標記物，能夠高通量有效區(qū)分大腸桿菌和志賀氏菌屬［6］。

納升級反相液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(nano-RPLC-MS/MS)檢測生物大分子具有極高的靈敏度和精確度，在生物醫(yī)學領(lǐng)域特別是在蛋白質(zhì)分析中得到了廣泛的應用。Zhang等通過比較人類胃腺癌細胞與正常胃黏膜上皮細胞，利用納升級反相液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定78種蛋白，發(fā)現(xiàn)細胞系膜聯(lián)蛋白A1的表達上調(diào)與人類胃腺癌密切相關(guān)［7］。于海洋等利用納升級反相液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法系統(tǒng)分析了錦燈籠果實的提取蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，數(shù)據(jù)庫檢索到60種蛋白［8］。陳霞等結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物，膠內(nèi)酶解鑒定到72種蛋白質(zhì)，直接酶解鑒定到97種蛋白質(zhì)［9］。筆者引入蛋白質(zhì)組學研究方法，采用了高靈敏度的納升級反相液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，對分離自美國龍蝦的一株麥氏弧菌提取蛋白質(zhì)進行溶液內(nèi)酶解，對直接酶解產(chǎn)物進行分析，并對鑒別到的蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分及功能活性進行分析，較系統(tǒng)地研究了麥氏弧菌提取蛋白質(zhì)，為麥氏弧菌蛋白質(zhì)組學的深入研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 納升級液相色譜系統(tǒng):Eksigent NanoLC-Ultra?液相系統(tǒng);高分辨質(zhì)譜系統(tǒng):TripleTOFTM5600+，配有電噴霧離子源(ESI)和ProteinPilot 4．5蛋白質(zhì)分析軟件(美國AB Sciex公司)，假陽性率控制在小于1%。

十二烷基磺酸鈉(SDS)，購于SIGMA公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、甲基磺酰氟(PMSF)，購于Amesco公司，級別為ultra pure grade;離心機為德國eppendorf centrifuge公司;牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍染料G250、蛋白分子量Marker，購于生工生物工程(上海)有限公司;二硫蘇糖醇(DTT)、尿素(UREA)、碘乙酰胺(IAM)、四乙基溴化銨(TEAB)，購于Promega公司;胰蛋白酶(Trypsin，Promega質(zhì)譜測序級);乙腈、甲酸等質(zhì)譜用試劑均為質(zhì)譜級(德國Merck公司);該試驗中涉及到的其他化學試劑為分析純。

麥氏弧菌F5-1，分離自進口美國的美國龍蝦(Homarus americanus)腹部。

1．2 麥氏弧菌總蛋白的提取 麥氏弧菌在4℃，10 000 r/min，離心5 min，收集菌細胞沉淀。菌細胞置于1．5 ml離心管中，加入300μl裂解液，超聲5 min。超聲條件:起動時間2 s，超聲間隔3 s，超聲功率180 W;裂解液緩沖液的配制:8 mol/L 尿素，30 mmol/L HEPES，1 mmol/L PMSF，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT。超聲后，離心30 min，取上清，加入DTT至終濃度10 mmol/L。56℃水浴1 h，取出后，迅速加入IAM至終濃度55 mmol/L，暗室靜置1 h，加入4倍于樣品溶液體積的預冷丙酮，－20℃沉淀3 h以上。離心30 min，取沉淀，加入700μl的復溶緩沖液，終濃度為50%TEAB，0．1%SDS。超聲3 min助溶，超聲條件同上。離心30 min，取上清。提取蛋白樣品使用bradford法對蛋白進行定量，SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)提取情況。

1．3 麥氏弧菌蛋白質(zhì)直接酶解 取麥氏弧菌蛋白約50μg，加1 mol/L DTT至終濃度10 mmol/L;蛋白溶液pH為8．0，56℃孵育60 min，冷卻至室溫。加入1 mol/L IAM至終濃度60 mmol/L，室溫暗 處 孵 育 60 min。加 入 50 mmol/L NH4HCO3稀釋尿素至終濃度不超過1 mol/L，按照胰蛋白酶與麥氏弧菌蛋白的量之比在1∶20 ～1∶100，加入1μg胰蛋白酶，37℃孵育過夜，再次加入同等劑量的胰蛋白酶，室溫孵育24 h，得到麥氏弧菌總蛋白直接酶解液。

1．4 NanoL C-MS/MS分析 直接酶解液加入0．1%甲酸溶液，10 000 r/min，4℃離心后取上清液注入Nano LC-MS/MS儀器分析。

液相為Eksigent NanoLC-Ultra液相系統(tǒng)，色譜條件為:樣品以300 nl/min上樣到C18預柱上(Nano cHiPLC Trap column，200 μm ×0．5 mm ChromXPC18-CL 3 μm120 ?)，然后保持流速沖洗脫鹽10 min。分析柱是cHiPLC反相柱(Nano cHiPLC column，75 μm × 15 cm ChromXP C18-CL 3 μm 120 ?)，上樣量5μl，流動相A:2%乙腈(0．1% 甲酸)，B:98%乙腈(0．1%甲酸);流速300 nl/min，自動進樣。梯度洗脫條件為:0 ～55 min，5% ～23%B;55～75 min，23% ～52%B;75～76 min，55% ～80%B;76 ～80 min，80%B;80 ～90 min，80% ～5%B，分析時間為90 min。

質(zhì)譜檢測條件:AB SCIEX TripleTOFTM5600+，ESI源，正離子掃描方式，離子源氣體1:27．58 kPa，氣簾:206．84 kPa，離子噴霧電壓:2．3 kV。一級質(zhì)譜掃描范圍m/z350～1 250，250 ms，選擇一級圖譜最高的40個峰進行二級掃描。IDA(information dependent acquisition)掃描范圍m/z100～1 500，電荷數(shù)為2～5的母離子被選擇進行MS/MS分析。

1．5 麥氏弧菌蛋白鑒定 試驗得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果，在uniprot網(wǎng)站中麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii CIP 69．14)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行檢索，數(shù)據(jù)庫下載于網(wǎng)址“http://www．uniprot．org/uniprot/?query=Vibrio+metschnikovii＆sort=score”，包含3 089條蛋白信息。數(shù)據(jù)庫檢索軟件為Protein-Pilot 4．5，參數(shù)的選擇如下:樣本類型:Identification;半胱氨酸烷基化:IAA;蛋白消化:Trypsin;儀器設備:TripleTOFTM5600+;特殊因子:None;種類:None;關(guān)注信息:Biological modifications Amino acid subsitution;數(shù)據(jù)庫:Vibiro metschnikovii;搜索方式:Thorough;FDR統(tǒng)計分析:Yes。

2 結(jié)果與分析

2．1 提取蛋白的分析 麥氏弧菌提取蛋白使用bradford法對蛋白進行定量，定量標準曲線為:y=0．193x+0．004，R2=0．995，其中y為吸光度(595 nm)，x為BSA濃度，定量濃度為1．5 μg/μl。上清液 SDS-PAGE 電泳上樣，上樣量為10 μl，電泳結(jié)果見圖1。

2．2 質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索 采用Nano LC-MS/MS對麥氏弧菌提取蛋白進行分析。上樣量7．5μg，采集時間90 min，IDA掃描峰數(shù)為40時，一級圖譜響應值約2．5×107，二級圖譜為42 027張(圖2)，色譜質(zhì)譜圖結(jié)果顯示，在梯度時間內(nèi)多肽組分分離良好，為質(zhì)譜在單位時間內(nèi)采集更多的數(shù)據(jù)提供了有利條件。

質(zhì)譜分析的數(shù)據(jù)在uniprot網(wǎng)站中麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii CIP 69．14)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行檢索，檢索結(jié)果通過嚴格標準進行篩選(1%FDR，即所有鑒定到的蛋白質(zhì)其可靠性在99%以上)，直接酶解鑒定到的蛋白數(shù)量為1 538個。鑒定的蛋白主要是參與代謝進程的酶類，如Glutamate dehydrogenase，Phosphoglycerate kinase;參與細胞生理過程的酶類，如 Adenosine deaminase，Na(+)-translocating NADH-quinone reductase;參與生物調(diào)節(jié)的酶類，如Lon protease，Zinc metalloprotease等。通過Gene Ontology分析(GO分析)，對鑒定到的蛋白通過BLAST提取基因進行分析，考察了麥氏弧菌分離菌株F5-1提取蛋白的分子功能、生物進程和細胞組分，具體分布見圖3。

由圖3A分子功能可見，具有催化活性的功能蛋白占較大比例，還有結(jié)合活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性等功能蛋白。鑒定到的具有催化活性的蛋白質(zhì)，如磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Glucose-6-phosphate isomerase)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphate isomerase)、果糖二磷酸醛縮酶(Fructose-bisphosphate aldolase)等大部分是糖代謝相關(guān)蛋白，為麥氏弧菌細胞提供能量。

麥氏弧菌中具有結(jié)合活性蛋白，主要是核酸結(jié)合蛋白，如GTP結(jié)合蛋白(GTP-binding protein)、DNA結(jié)合蛋白(DNA-binding protein)、ABC轉(zhuǎn)運蛋白的ATP結(jié)合蛋白(ABC transporter ATP-binding protein)等，與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)負責細胞內(nèi)DNA分子遺傳信息的組織、復制和閱讀。

該研究還鑒定到絲氨酸蛋白激酶(Serine protein kinase，SPK)，一類能使特定底物蛋白中絲氨酸羥基磷酸化的酶。SPK通過催化酶、受體、運輸?shù)鞍住⒄{(diào)節(jié)蛋白、核內(nèi)蛋白等多種功能蛋白的磷酸化，改變蛋白的構(gòu)象，調(diào)節(jié)細胞多種生命活動過程［10－11］。作為蛋白激酶大家族中的一員，SPK過去曾被認為是真核生物所獨有的，大量的相關(guān)研究也集中在真核生物中［12－13］，之后在黃色粘球菌、集胞藻、革蘭氏陽性無乳鏈球菌等原核生物中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)［14－16］。研究發(fā)現(xiàn)，SPK可能參與結(jié)核分枝桿菌致病過程中的多個環(huán)節(jié)，并與致病性相關(guān)［17］，這提示麥氏弧菌的致病性可能有絲氨酸蛋白激酶的參與。

3 結(jié)論

研究細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式的學科即為蛋白質(zhì)組學(proteomics)［18］，主要包括結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學和功能蛋白質(zhì)組學。蛋白質(zhì)組學的研究對象通常為具有高度復雜性的蛋白質(zhì)或多肽的混合物，其技術(shù)可分為分離和鑒定2個方面。其中分離的技術(shù)手段以雙向凝膠電泳和液相色譜為核心，而鑒定則主要依靠質(zhì)譜技術(shù)。雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)作為研究蛋白質(zhì)組學最廣泛技術(shù)手段，其局限性在于分離能力有限、存在歧視效應、操作程序復雜等缺陷，對于分析動態(tài)范圍大、低豐度以及疏水性蛋白質(zhì)的研究往往很難得到滿意的結(jié)果。利用高效液相色譜技術(shù)分離蛋白質(zhì)，并用高分辨質(zhì)譜鑒定收集的組分，是最近發(fā)展起來的研究蛋白質(zhì)組學有效技術(shù)手段［19－21］。

蛋白質(zhì)組學研究要求有高分辨率的蛋白質(zhì)分離及準確、靈敏的質(zhì)譜鑒定技術(shù)。該研究采用納升級反相液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析麥氏弧菌總蛋白的方法，具有高通量、高靈敏的特點，高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)分析了麥氏弧菌提取蛋白直接酶解肽段，數(shù)據(jù)庫檢索得到預測蛋白質(zhì)氨基酸序列，通過與數(shù)據(jù)庫中已知序列比對，鑒定到1 538種蛋白，蛋白鑒定數(shù)目約占物種Vibiro metschnikovii CIP 69．14總蛋白數(shù)的50%，進一步分析了部分提取蛋白質(zhì)的生物學功能，為麥氏弧菌功能蛋白質(zhì)組的深入研究奠定了基礎。

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