劉宇帥，曹 旭，陳靜宇，孟利強(qiáng)，張淑梅，胡基華，姜 威，李 晶*

(1．黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱150001;2．黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010)

近年來(lái)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植面積不斷擴(kuò)大，但同時(shí)馬鈴薯病害日趨嚴(yán)重，馬鈴薯絲核菌病就是其中之一，該病不僅發(fā)病普遍，危害程度也越來(lái)越重，嚴(yán)重者可達(dá)5%左右，降低20%的產(chǎn)量，并影響品質(zhì)，該病害已成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大障礙［1］。馬鈴薯絲核菌病又稱黑痣病、絲核菌潰瘍病，病原菌是一種真菌，其無(wú)性階段是立枯絲核菌。該病原菌寄主范圍廣泛，在全世界的耕作及非耕作土壤中均有分布，許多絲核菌很容易從染病植株及土壤中分離得到。該病原菌易引起植物爛種、苗期猝倒，在土壤中的腐生競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，存活時(shí)間長(zhǎng)，其菌核在塊莖上或土壤中越冬，次年根據(jù)環(huán)境條件又可發(fā)生侵染。因此，馬鈴薯絲核菌病是一種種薯帶病和土壤傳播相結(jié)合的病害，從而給防治帶來(lái)很大困難［2－5］。

馬鈴薯絲核菌病的傳統(tǒng)防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治。近年來(lái)，由于傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治方法不能從根本上控制病害的發(fā)生，防治效果往往不穩(wěn)定;而化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性，過(guò)量使用農(nóng)藥還會(huì)破壞土壤的微生態(tài)環(huán)境，加重農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染，造成有毒有害物質(zhì)在農(nóng)作物體內(nèi)過(guò)多殘留。因此，生物防治方法的研究越來(lái)越受到人們的重視，如利用微生物之間的拮抗作用，選擇對(duì)農(nóng)作物不造成危害的微生物來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)［6］。為此，筆者篩選了對(duì)馬鈴薯絲核病菌具有拮抗作用的生防菌，并對(duì)其拮抗作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，旨在為馬鈴薯絲核菌病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試菌。馬鈴薯絲核病菌由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所贈(zèng)送，供試驗(yàn)篩選所用細(xì)菌均為實(shí)驗(yàn)室保藏的生防菌株。

1．1．2 培養(yǎng)基。NYD 培養(yǎng)基:牛肉浸膏8．0 g，酵母膏5．0 g，葡萄糖10．0 g，蒸餾水1 000 ml，若固體培養(yǎng)基需加瓊脂15．0 g，pH7．2 ～ 7．5;PD 培養(yǎng)基:馬鈴薯 200．0 g，葡萄糖20．0 g，蒸餾水 1 000 ml，若固體培養(yǎng)基需加瓊脂 15．0 g，pH7．2 ～7．5;黑麥液體培養(yǎng)基:黑麥 100．0 g，蔗糖 15．0 g，碳酸鈣 1．4 g，蒸餾水 1 000 ml，若固體培養(yǎng)基需加瓊脂 15．0 g。

1．2 方法

1．2．1 生防菌株的篩選。

1．2．1．1 初篩。對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有保藏的生防細(xì)菌菌株(CZS、LKS、WHS、PB12、B10、CZL、ZH2、B29、JK)挑取單菌落，分別接于5 ml NYD試管中，于35℃、170 r/min振蕩器中培養(yǎng)18 h待用。將保存在斜面上的馬鈴薯絲核病菌接PDA平板，置于28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。在PDA培養(yǎng)基平板上劃十字線分出4個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域中心分別接入直徑為8 mm的靶標(biāo)病原菌菌餅，同時(shí)在平板十字線上劃入待測(cè)生防菌液，設(shè)無(wú)生防菌液為對(duì)照，4次重復(fù)，于25℃下培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照真菌長(zhǎng)至十字線位置時(shí)觀察處理組抑菌效果。

1．2．1．2 復(fù)篩。經(jīng)過(guò)初篩獲得7株具有拮抗作用的細(xì)菌，采用“1．2．1．1”方法繼續(xù)進(jìn)行復(fù)篩，當(dāng)對(duì)照真菌長(zhǎng)至十字線位置時(shí)觀察處理組抑菌效果。測(cè)量抑菌帶寬，計(jì)算抑菌率。將抑菌效果大于50%的生防菌進(jìn)行純化保藏。

抑菌率=(對(duì)照菌絲直徑－處理菌絲直徑)/對(duì)照菌絲直徑×100%

1．2．2 生防菌株的拮抗作用測(cè)定。對(duì)具有較強(qiáng)拮抗效果的2株生防細(xì)菌挑取單菌落，分別接于5 ml NYD試管中，于30℃、150 r/min振蕩器中培養(yǎng)24 h。再以2%的接種量分別接種于50 ml NYD三角瓶中，于30℃、150 r/min振蕩器中培養(yǎng)45 h待用。將保存的馬鈴薯絲核病菌接于PDA平板，置于28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。

1．2．2．1 液體培養(yǎng)條件下的拮抗作用測(cè)定。將PB12與CZS菌液分別進(jìn)行10倍、100倍梯度稀釋，然后在50 ml PD液體培養(yǎng)瓶中以2%的接種量分別加入細(xì)菌原液及各稀釋度菌液1 ml。再于每瓶中分別接入直徑為8 mm的靶標(biāo)病原菌菌餅，設(shè)未接種生防菌液為對(duì)照，3次重復(fù)，置于28℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。每天對(duì)真菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，到第4天停止培養(yǎng)，此時(shí)對(duì)照組真菌生長(zhǎng)量明顯多于試驗(yàn)組。將菌絲過(guò)濾，置于陰涼干燥處晾干后稱其干重，并計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(對(duì)照菌絲重量－處理菌絲重量)/對(duì)照菌絲重量×100%

1．2．2．2 固體培養(yǎng)條件下的拮抗作用測(cè)定。將PB12與CZS菌液分別進(jìn)行10倍、100倍梯度稀釋，然后在PDA培養(yǎng)基平板上均勻涂滿細(xì)菌原液及各稀釋度菌液100μl。晾干后每平板分別接入直徑為8 mm的靶標(biāo)病原菌菌餅，設(shè)未涂生防菌液為對(duì)照，3次重復(fù)，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天對(duì)真菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，測(cè)量菌絲直徑，并計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(對(duì)照菌絲直徑－處理菌絲直徑)/對(duì)照菌絲直徑×100%

1．2．2．3 生防菌對(duì)馬鈴薯絲核病菌菌核形成的影響。將PB12與CZS菌液分別進(jìn)行10倍、100倍梯度稀釋，然后在PDA培養(yǎng)基平板上均勻涂滿各濃度的菌液100μl(包括細(xì)菌原液及各稀釋度菌液)。晾干后每平板分別接入直徑為8 mm的靶標(biāo)病原菌菌餅，設(shè)未涂生防菌液為對(duì)照，3次重復(fù)，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期對(duì)菌核形成情況進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2．1 馬鈴薯絲核菌病生防菌的篩選 通過(guò)平板抑菌對(duì)峙試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有生防菌株的抑菌能力進(jìn)行測(cè)定，篩選出7株抑菌能力不同的細(xì)菌。其中，菌株P(guān)B12和CZS的抑菌效果較明顯，通過(guò)對(duì)抑菌帶寬度的測(cè)量可知，菌株P(guān)B12的抑菌率為59．82%，菌株 CZS 為56．37%(表1)。

2．2 菌株P(guān)B12、CZS對(duì)絲核菌的拮抗作用

2．2．1 液體培養(yǎng)條件下的拮抗作用。通過(guò)共培養(yǎng)的方法對(duì)菌株P(guān)B12、CZS的拮抗作用進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明在液體培養(yǎng)條件下，對(duì)照組中絲核菌菌絲迅速生長(zhǎng)成團(tuán)塊，而加有生防菌株的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)菌絲生長(zhǎng)緩慢。第4天時(shí)停止培養(yǎng)，將各組菌絲進(jìn)行過(guò)濾、晾干、稱重。由圖1可知，對(duì)照組菌絲團(tuán)塊明顯大于各試驗(yàn)組菌絲團(tuán)塊，同時(shí)隨著稀釋度的增加，試驗(yàn)組團(tuán)塊的大小無(wú)明顯變化。通過(guò)計(jì)算各組菌絲團(tuán)塊的重量表明，菌株P(guān)B12和CZS均能夠抑制馬鈴薯絲核病菌菌絲的生長(zhǎng)，抑菌率達(dá)到98．00%。不同濃度的生防菌液(原液、稀釋10倍和100倍)對(duì)抑菌效果影響較小(表2)。

表1 供試菌株對(duì)絲核菌的防治效果

2．2．2 固體培養(yǎng)條件下的拮抗作用。通過(guò)平板抑菌試驗(yàn)對(duì)菌株P(guān)B12、CZS的拮抗作用進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明在固體培養(yǎng)條件下，對(duì)照組中絲核菌菌絲逐漸生長(zhǎng)且菌絲致密、健壯，而涂有生防菌株的培養(yǎng)皿內(nèi)菌絲生長(zhǎng)緩慢，當(dāng)培養(yǎng)至第3天時(shí)對(duì)照組菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平板，試驗(yàn)組各菌絲稀疏，長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于對(duì)照組，在培養(yǎng)中后期幾乎不再生長(zhǎng)(圖2)。通過(guò)對(duì)菌絲直徑計(jì)算表明，菌株P(guān)B12和CZS對(duì)馬鈴薯絲核菌的抑菌率雖然沒有液體條件下的抑菌率高，但幾乎可達(dá)到60%以上，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)抑菌能力逐漸升高，其中菌株P(guān)B12的抑菌率可達(dá)到79．82%。不同濃度的生防菌液(原液、稀釋10倍和100倍)對(duì)抑菌效果存在影響，隨著稀釋度的增加抑菌能力下降(表3)。

表2 液體培養(yǎng)條件下絲核菌生防菌株P(guān)B12與CZS的拮抗效果

2．2．3 生防菌對(duì)馬鈴薯絲核病菌菌核形成的影響。菌核是由菌絲緊密連接交織而成的休眠體，能夠抵御外界不良環(huán)境。當(dāng)環(huán)境適宜時(shí)，菌核能萌發(fā)產(chǎn)生新的營(yíng)養(yǎng)菌絲或從上面形成新的繁殖體。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)到第14天時(shí)，對(duì)照組開始形成黑色菌核，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)菌核逐漸變大、增多、大小不一、具有光澤且都聚集在菌落中心。而整個(gè)培養(yǎng)期間涂有不同濃度生防菌液(原液、稀釋10倍和100倍)的各試驗(yàn)組均未發(fā)現(xiàn)菌核的形成(圖3)。因此，生防菌PB12和CZS在抑制馬鈴薯絲核菌菌絲正常生長(zhǎng)的同時(shí)也抑制了其菌核的形成，削弱了絲核菌抵御不良環(huán)境的能力。

表3 固體培養(yǎng)條件下絲核菌生防菌株P(guān)B12與CZS的拮抗效果

3 結(jié)論與討論

該研究篩選出2株對(duì)馬鈴薯絲核病菌抑菌率達(dá)98%的生防菌株P(guān)B12和CZS，通過(guò)抑菌試驗(yàn)表明，無(wú)論是在液體培養(yǎng)條件下還是固體培養(yǎng)條件下，菌株P(guān)B12和CZS對(duì)馬鈴薯絲核病菌的拮抗作用都十分穩(wěn)定，在液體培養(yǎng)時(shí)生防菌液稀釋度的變化對(duì)抑菌效果無(wú)明顯影響，在固體培養(yǎng)時(shí)隨著生防菌液稀釋度的增加抑菌能力稍有下降，同時(shí)該2株生防菌均可抑制絲核病菌菌核的形成，削弱絲核菌抵御外界不良環(huán)境的能力。

利用微生物之間的拮抗作用防治植物病害的研究較多［7］，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)馬鈴薯絲核菌病害的報(bào)道多集中于病原菌的生物學(xué)特性、傳播以及化學(xué)防治方面，對(duì)該病原菌生物防治的報(bào)道很少。植物病害的防治受植物、病原物、拮抗菌、環(huán)境條件等多方面因素的影響［8］。有研究表明，病原菌立枯絲核菌是一種全世界大量農(nóng)作物和野生寄主的病原物，當(dāng)該病菌侵染到馬鈴薯上，隨著土壤濕度的增大，新薯塊上的菌核形成會(huì)加重。新塊莖上形成的菌核或在土壤中越冬的菌核次年根據(jù)環(huán)境條件又可發(fā)生侵染，給防治帶來(lái)很大困難［3］。

該研究篩選出的生防菌株P(guān)B12和CZS對(duì)馬鈴薯絲核病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，對(duì)病原菌菌絲有抑制作用，更重要的是能夠顯著抑制馬鈴薯絲核菌菌核的形成，表現(xiàn)出防治菌核病的潛力，可提高馬鈴薯產(chǎn)量及品質(zhì)，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。針對(duì)該2株生防菌的抗菌機(jī)理、在馬鈴薯活體上是否具有相同的拮抗作用以及田間防效等試驗(yàn)將在后續(xù)研究中進(jìn)行。

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［2］曹春梅，李文剛，張建平，等．馬鈴薯黑痣病的研究現(xiàn)狀［J］．中國(guó)馬鈴薯，2009，23(3):171 －173．

［3］王春媛．馬鈴薯絲核菌潰瘍病及其防治措施［J］．農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2013(6):106．

［4］SUWANNARACH N，KUMLA J，BUSSABANB，et al．Biocontrol of rhizoctonia solani AG-2，the causal agent of damping-off by Muscodor cinnamomi CMU-Cib 461［J］．World journal of microbiology ＆ biotechnology，2012，28(11):3171－3177．

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