翁繩鳳，劉宏蘊(yùn)，宋 洋，王 艷，商繼周(北京老年醫(yī)院檢驗科 100095)

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·臨床探討·

老年醫(yī)院腸桿菌科細(xì)菌耐藥分析

翁繩鳳，劉宏蘊(yùn)，宋 洋，王 艷，商繼周
(北京老年醫(yī)院檢驗科 100095)

目的 了解北京老年醫(yī)院2010～2012年臨床常見腸桿菌科細(xì)菌耐藥情況及研究耐碳青霉烯類細(xì)菌基因類別。方法 收集該院2010～2012年臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌1 528株，對亞胺培南和美羅培南敏感性下降的菌株采用改良Hodge試驗進(jìn)行產(chǎn)碳青霉烯酶確認(rèn)，PCR擴(kuò)增試驗分析其耐藥基因類別。結(jié)果 1 528株腸桿菌科細(xì)菌中，排前3位的細(xì)菌是大腸埃希菌(48.49%)、肺炎克雷伯菌(22.84%)及變形桿菌屬(18.39%)。其中大腸埃希菌對3代頭孢菌素類和喹諾酮類藥物耐藥率達(dá)80%以上；阿米卡星及哌拉西林/他唑巴坦，頭孢哌酮/舒巴坦(含酶抑制劑復(fù)合抗菌藥)對主要腸桿菌科細(xì)菌仍保持較高的抗菌活性；對美羅培南耐藥5株，亞胺培南中介敏感4株。經(jīng)改良Hodge試驗確證：4株為產(chǎn)碳青霉烯酶株，均為肺炎克雷伯菌，PCR檢測均為碳青霉希酶blaKPC-2基因型。結(jié)論 該院產(chǎn)碳青霉希酶的腸桿菌科細(xì)菌均為肺炎克雷伯菌且均為blaKPC-2基因型。臨床與實驗室應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)控，防止耐藥基因的傳播。

腸桿菌科； 碳青霉烯酶； 抗藥性； 基因型

老年人免疫功能低下，病情復(fù)雜，住院時間較長，廣譜抗菌藥物的不合理使用，造成耐藥菌株的增加，已成為臨床治療棘手的問題。腸桿菌是臨床重要醫(yī)院感染菌，近年來腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥現(xiàn)象日趨增加[1-2]，給臨床抗感染治療帶來極大困難。因此，本文對2010年至2012年臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行耐藥分析并研究碳青霉烯酶KPC基因類別，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集本院2010年1月至2012年12月住院患者所有標(biāo)本中分離出腸桿菌科細(xì)菌，共1 528株。剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株。

1.2 藥敏試驗 采用Phoenix100全自動分析儀進(jìn)行藥物敏感試驗，K-B紙片擴(kuò)散法作為藥敏補(bǔ)充試驗。結(jié)果按美國2010年版CLSI中判讀標(biāo)準(zhǔn)報告?？咕幬锛埰八幟粼囼炁囵B(yǎng)基MH瓊脂均為英國OXOID公司產(chǎn)品。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603。采用WHONET5.6進(jìn)行耐藥性分析。

1.3 碳青霉烯酶檢測 對頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢他啶中一種或多種耐藥；美羅培南最低抑菌濃度(MIC)≥2 μg/mL;亞胺培南MIC≥2 μg/mL，滿足以上任一項的腸桿菌科菌株進(jìn)行Hodge試驗，確證是否產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.4 改良Hodge試驗 制備0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922 菌液，10倍稀釋，用棉簽取菌液均勻涂抹M-H平板，中間貼亞胺培南10 μg紙片，再用無菌接種環(huán)將待測菌株從紙片邊緣向外劃線；陰性對照用ATCC700603，陽性對照為KPC-2 的肺炎克雷伯菌。35 ℃培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果。

1.5 PCR擴(kuò)增及測序 Hodge 試驗陽性的菌株送至北京大學(xué)臨床藥理研究所進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，檢測其耐藥基因型。

2 結(jié) 果

2.1 腸桿菌科細(xì)菌分離情況 1 528株腸桿菌科細(xì)菌中，排前3位的細(xì)菌是大腸埃希菌741株(48.49%)、肺炎克雷伯菌349株(22.84%)及變形桿菌屬281株(18.39%)。

2.2 藥敏試驗結(jié)果 1 528株腸桿菌科細(xì)菌中759株(49.67%)對第3代頭孢菌素類(頭孢噻肟)耐藥，746株(48.82%)對第4代頭孢菌素類(頭孢吡肟)耐藥，5株對美羅培南耐藥，4株對亞胺培南呈中介敏感性。其中2株為大腸埃希菌，7株為肺炎克雷伯菌。碳青霉烯類(亞胺培南、美羅培南)、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦(含酶抑制劑復(fù)合抗菌藥)對主要腸桿菌科細(xì)菌仍保持較高的抗菌活性，菌株對頭孢菌素類及氟喹諾酮藥物耐藥性較高。結(jié)果見表1。

表1 2010～2012年常見腸桿菌科分離菌耐藥率(%)

續(xù)表1 2010～2012年常見腸桿菌科分離菌耐藥率(%)

注：1705為陽性對照，1706為陰性對照。

圖1 改良Hodge試驗結(jié)果

注：ndm-新德里金屬酶。

圖2 PCR擴(kuò)增ndm基因結(jié)果

注：kpc-肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶。

圖3 PCR擴(kuò)增blaKPC 基因結(jié)果

2.3 改良Hodge 試驗結(jié)果 4株Hodge 試驗陽性，均為肺炎克雷伯菌，與陽性對照一樣，菌落出現(xiàn)矢狀生長，其他菌株均為陰性。見圖1(以菌株編號10NDM120為例)。

2.4 PCR擴(kuò)增blaKPC及DNA測序比對 Hodge試驗陽性菌株送至北京大學(xué)臨床藥理研究所進(jìn)行PCR檢測。檢測結(jié)果：實時定量熒光PCR法檢測ndm基因為陰性，普通PCR法檢測kpc基因為陽性。見圖2和圖3。

3 討 論

本院大多數(shù)是老年患者，基礎(chǔ)疾病多，容易反復(fù)感染，反復(fù)接受抗菌藥物治療更易出現(xiàn)耐藥菌。研究數(shù)據(jù)也表明耐藥率有所上升。如大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，原本敏感性較高的頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦現(xiàn)耐藥率在25%～50%；對頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟的耐藥率在50%～81%，可能與這些藥物過度使用有關(guān)。本研究結(jié)果同時發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥率在80%以上；肺炎克雷伯菌耐藥率也在38%～50%。超過中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測研究組的數(shù)據(jù)[3](大腸埃希菌對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥率高達(dá)50%～60%)。這是因為氟喹諾酮類藥物為廣譜抗菌藥物，被作為感染預(yù)防手段廣泛用于臨床。阿米卡星對主要3種腸桿菌科細(xì)菌仍保持較高抗菌活性(耐藥率在10%～21%)。

目前，碳青霉烯類藥物耐藥的腸桿菌科細(xì)菌已在很多國家出現(xiàn)和被報道[4-7]，特別是產(chǎn)KPC和金屬酶的腸桿菌科細(xì)菌在全球許多地區(qū)已出現(xiàn)暴發(fā)流行。鑒于此，CLSI提出，當(dāng)腸桿菌科細(xì)菌對一種或多種第3代頭孢菌素耐藥并對碳青霉烯類藥物的MIC有升高(厄他培南、亞胺培南、美羅培南之一的MIC≥2 μg/mL)，需對菌株進(jìn)行碳青霉烯酶表型確證試驗[8]。CLSI認(rèn)為改良Hodge試驗在確證碳青霉烯酶時敏感度和特異度均超過90%，雖然有報道稱改良Hodge試驗在檢測產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶菌株時會出現(xiàn)假陽性結(jié)果[9]，但靈敏度與特異度仍高于傳統(tǒng)方法，而且操作相對簡單，值得實驗室推廣，及早發(fā)現(xiàn)耐藥株。

本研究中碳青霉烯酶類藥物敏感性下降占1.4%左右，發(fā)現(xiàn)耐亞胺培南或美羅培南肺炎克雷伯菌。近年來研究發(fā)現(xiàn)炎癥、基礎(chǔ)疾病，氟喹諾酮類藥物的應(yīng)用，廣譜頭孢菌素的應(yīng)用及曾接受碳青霉烯類藥物的治療成為對碳青霉烯類藥物耐藥的肺炎克雷伯菌的獨立危險因素[10]。

KPC-2首先在肺炎克雷伯菌中被發(fā)現(xiàn)[11]。產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶菌株在世界各地均有報道，已發(fā)現(xiàn)其宿主菌包括肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、沙門菌屬和大腸埃希菌等腸桿菌科細(xì)菌[12-15]。本次研究顯示本院產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌均為肺炎克雷伯菌且基因型為blaKPC-2，未發(fā)現(xiàn)其他產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌。目前碳青霉烯類抗菌藥物對常見腸桿菌科細(xì)菌仍保持較高的抗菌活性(耐藥率低于2%)，是目前治療多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染的首選。但研究顯示在本院這類藥也在面臨挑戰(zhàn)，出現(xiàn)不同程度耐藥。雖然出現(xiàn)例數(shù)不多，但也是預(yù)警信號，細(xì)菌耐藥監(jiān)測是一項長期而重要的工作，臨床與實驗室應(yīng)重視對此類細(xì)菌的監(jiān)測，防止耐藥基因在細(xì)菌間傳播。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.048

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1672-9455(2015)21-3250-03

2015-02-25

2015-06-28)