劉小敏，唐恒鋒，李文郎，楊美玲(.廣東省深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院檢驗科 580；.廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院 5809)

?

·論 著·

高脂血、溶血標本對熒光定量聚合酶鏈反應測定低水平HBV-DNA的影響

劉小敏1，唐恒鋒1，李文郎1，楊美玲2
(1.廣東省深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院檢驗科 518110；2.廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院 518109)

目的 探討高脂血、溶血標本對熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)測定低水平HBV-DNA檢測結(jié)果的影響。方法 對收治的100例三酰甘油(TG)正常(TG≤1.46 mmol/L)、實時熒光定量PCR測定為(4.0～9.0)×103IU/mL的乙型肝炎患者采集血清標本，進行即刻檢測，另外選擇100份乙肝五項全陰且測不出HBV-DNA的高TG標本和100份乙肝五項全陰且測不出HBV-DNA的全血標本分別制備成高脂血、溶血血清標本，同時進行高脂血和非高脂血、溶血血清和非溶血血清的HBV-DNA熒光定量PCR檢測，并進行配對t檢驗。結(jié)果 高脂血和非高脂血、溶血血清和非溶血血清的HBV-DNA水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 高脂血、溶血標本低水平HBV-DNA熒光定量PCR定量檢測結(jié)果較空腹采集即刻檢測的結(jié)果降低。

標本； 溶血； 高脂血； 熒光定量聚合酶鏈反應

乙型肝炎(乙肝)是由乙肝病毒(HBV)引起的以肝損害為主的傳染性疾病，流行廣、發(fā)病率高。HBV-DNA的定量能客觀反映HBV感染復制情況，為臨床用藥、治療監(jiān)測及預后判斷方面提供有價值的參考依據(jù)[1]。目前用于HBV-DNA定量測定的基本方法是熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)，特異性和敏感性高，可實時檢測，操作方便，定量范圍寬，重復性好，不易引起污染等[2]。干擾PCR擴增的因素很多，除反應體系外，標本因素的影響不可忽視。作者就高脂血、溶血標本對低水平HBV-DNA 熒光定量PCR檢測結(jié)果的影響作一些探討，制訂出適合本實驗室的標本采集、儲存、重留標準，以使實驗結(jié)果更為可靠。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年3月至2013年3月本院肝病門診三酰甘油(TG)正常(TG ≤1.46 mmol/L)、實時熒光定量PCR測定為(4.0～9.0)×103IU/mL的乙肝患者共100例。另外選擇100份乙肝五項全陰且測不出HBV-DNA的高TG標本和100份乙肝五項全陰且測不出HBV-DNA的全血標本，均來自于2012年3月至2013年3月本院肝病門診。

1.2 儀器與試劑 日本Sysmex K6000血液分析儀，AU5821生化分析儀，ABI-7500 PCR儀(美國)以及乙肝病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)。

1.3 方法 血紅蛋白、總膽紅素和TG的測定：100例乙肝患者分別空腹抽取靜脈血3 mL，離心后將血清混勻，備用。采用日本的Sysmex K6000血液分析儀測定血紅蛋白，AU5821生化分析儀測定總膽紅素和TG。

脂血標本的制備：100份乙肝五項全陰且測不出HBV-DNA的高TG標本，分別離心后取血清混勻并用生理鹽水稀釋成TG濃度分別為35、25、15、10、5 mmol/L的溶液。將上述HBV-DNA陽性、實時熒光定量PCR 測定為(4.0～9.0)×103IU/mL的乙肝患者混合血清分成5組，分別與各濃度TG溶液1∶1混合，制成模擬脂血標本。非脂血血清TG≤1.46 mmol/L。

溶血標本的制備：100份乙肝五項全陰且測不出HBV-DNA的全血標本，分別離心棄掉血清后用生理鹽水洗3遍，反復凍融至溶血；將溶血后的標本混勻并用生理鹽水稀釋成Hb濃度為30、60、120、240 g/L的溶液。將上述HBV 陽性、實時熒光定量PCR 測定為(4.0～9.0)×103IU/mL的乙肝患者混合血清分成5 組，分別與各濃度Hb溶液及生理鹽水(對照組)1∶1混合，制成模擬溶血標本。非溶血血清血紅蛋白濃度不超過2 g/L。

標本檢測：HBV-DNA試劑盒采用中山大學達安基因股份有限公司的乙肝病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒，儀器采用美國ABI-7500 PCR儀，實驗操作、反應體系及擴增條件嚴格按照試劑說明書進行。

1.4 評價指標 分析不同TG水平的脂血標本對低水平HBV-DNA熒光定量PCR檢測結(jié)果的影響，分析不同血紅蛋白水平的溶血血清對低水平HBV-DNA熒光定量PCR檢測結(jié)果的影響。

2 結(jié) 果

2.1 乙肝患者高脂血血清與非高脂血血清的HBV-DNA定量檢測結(jié)果 不同濃度的高TG血清和同組的非高脂血血清相比，低水平HBV-DNA的定量檢測結(jié)果有所降低，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 乙肝患者高脂血血清與非高脂血血清的HBV-DNA定量檢測結(jié)果±s)

注：和同組高脂血血清比較，*P<0.05。

2.2 乙肝患者不同程度的溶血血清與非溶血血清的HBV-DNA定量檢測結(jié)果 不同血紅蛋白含量的溶血血清和同組的非溶血血清相比，低水平HBV-DNA的定量檢測結(jié)果有所降低，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 乙肝患者不同程度的溶血血清與非溶血血清的HBV-DNA定量檢測結(jié)果±s)

注：和同組溶血血清比較，*P<0.05。

3 討 論

定量HBV-DNA能客觀反映HBV感染復制情況，在臨床用藥、治療監(jiān)測及預后判斷方面具有較高的臨床參考價值[3]。目前國內(nèi)用于HBV-DNA定量測定的方法基本上是熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)，這種技術(shù)具有實時測定，高特異性，高敏感性，快速方便，定量范圍寬，結(jié)果重復性好，且不易引起污染等優(yōu)點[4]。由于熒光定量PCR是監(jiān)測原始待測核酸模板的擴增過程，任何干擾PCR擴增的因素都會影響擴增效率和定量的準確性。

干擾PCR擴增的因素很多，除反應體系外，標本因素的影響不可忽視。目前臨床實驗室開展的質(zhì)量控制大多著重于實驗過程中，實驗前的質(zhì)量控制常被忽視。在標本采集中標本溶血、高脂血等因素是常常會遇到的，而這些因素對熒光定量PCR測定低水平HBV-DNA檢測結(jié)果有一定的影響。在乙肝抗病毒治療的過程中，臨床醫(yī)生會根據(jù)HBV-DNA水平的變化對藥物劑量進行調(diào)整，原則上以病毒含量下降為有效并直至其檢測不出[5]。目前，諸多試劑的檢測下限為1.0×103IU/mL，對于低于下限的以小于方式報告，而此時一般認為檢測不出HBV。因此，當?shù)退紿BV-DNA標本檢測時受標本的儲存、標本溶血、高脂血等因素的影響而使結(jié)果偏低甚至為陰性時，無法反映真實情況，如果據(jù)此改變治療方案，將會延誤治療造成病情反復，給患者帶來不必要的負擔[6]。目前，國內(nèi)外在標本的儲存、標本溶血、高脂血等因素對低水平HBV-DNA熒光定量PCR測定結(jié)果的影響方面報道較少，故作者就高脂血標本、溶血標本對低水平HBV-DNA熒光定量PCR測定結(jié)果的影響作一些探討，制訂出適合本實驗室的標本采集、儲存、重留標準，以使實驗結(jié)果更為可靠[7]。

血清TG是組成人血清乳糜微粒的主要物質(zhì)，高脂血血清標本混濁的主要原因是因為血液中的低密度脂肪(乳糜微粒及極低密度脂肪等)增多引起的，高脂血程度可用血清TG的水平進行衡量[8]。因此，本組實驗采用不同TG水平的高脂血血清標本和正常TG水平的血清標本進行對比，測定對低水平HBV-DNA熒光定量PCR測定的影響。本組試驗結(jié)果顯示，不同濃度的高TG血清和同組的非高脂血血清相比，低水平HBV-DNA的定量檢測結(jié)果有所降低。作者認為高脂血因素造成結(jié)果偏低的原因可能有：(1)高脂血因素導致熒光猝滅，使得熒光信號強度降低；(2)高脂血抑制Taq酶的活性，使PCR的擴增效率降低。

臨床研究已報道，血紅素可以通過它的卟啉環(huán)與Taq酶進行不可逆的結(jié)合，抑制了Taq酶的活性，使PCR的擴增效率降低，最終使試驗結(jié)果檢測的HBV-DNA水平降低[9-10]。本組試驗中，不同血紅蛋白水平的溶血血清和同組的非溶血血清相比，低水平HBV-DNA的定量檢測結(jié)果也有所降低。

總之，高脂血、溶血標本對低水平HBV-DNA熒光定量PCR測定結(jié)果有一定的影響，可根據(jù)具體情況制訂出適合本實驗室的標本采集、儲存、重留標準，以使試驗檢測結(jié)果更為可靠。

[1]吳禹湘，吳瑞珊，林曉丹，等.溶血對熒光定量PCR檢測不同含量HBVDNA的影響[J].分子診斷與治療雜志，2012，4(3)：189-192．

[2]張翠莉，劉萍，魏文波.脂血和溶血對HBVDNA實時熒光定量PCR檢測的影響[J].武警醫(yī)學，2012，23(2)：150-152．

[3]鄭有為，梁敏文，錢靖琳，等.熒光探針結(jié)合區(qū)序列突變對HBV DNA檢測的影響[J].熱帶醫(yī)學雜志，2012，12(7)：837-839．

[4]林森，易榮.實時熒光定量PCR對乙肝DNA檢測的影響因素[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33(1)：127-128．

[5]李軍，劉宏利，韓超，等.病毒接種劑量對HBV感染成年樹鼩的影響[J].免疫學雜志，2012，28(12)：1056-1060．

[6]楊曉瑞，吳學煒，臧利敏，等.HBV cccDNA SYBR Green Ⅰ熒光定量檢測方法的建立及初步應用[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012，39(16)：4200-4204．

[7]彭紅波，劉亞麗，陳旭姿.乙型肝炎病毒核酸熒光定量及血清標志物與肝功能檢測的臨床意義[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2012，9(18)：2260-2262．

[8]白彥樓，高英堂，李瑩，等.HBV cccDNA的水平及臨床因素對肝細胞癌術(shù)后預后的判斷價值[J].世界華人消化雜志，2012，20(9)：729-736．

[9]邊立忠，宋廣輝，趙素芝，等.LNA探針實時熒光定量PCR檢測HBV DNA的研究[J/CD].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2013，7(6)：2501-2506．

[10]蔣玲麗，王雪亮，肖艷群，等.熒光定量PCR測定HBV DNA測量不確定度評定的探討[J].檢驗醫(yī)學，2014，29(3)：241-244．

Influence of hyperlipemia and hemolysis specimens on fluorescence quantitative PCR determination of low level HBV-DNA

LIUXiao-min1,TANGHeng-feng1,LIWen-lang1,YANGMei-ling2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,LonghuaNewDistrictCentralHospital,Shenzhen,Guangdong518110,China;2.LonghuaNewDistrictPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518109,China)

Objective To investigate the influence of heperlipemia and hemolysis specimens on the fluorescence quantitative PCR determination results of low level HBV-DNA.Methods The serum samples were collected from 100 hepatitis B patients with normal triacylglycerol(TG) (≤1.46 mmol/L and (4.0-9.0)×103IU/mL by real time fluorescence quantitative PCR) in our hospital and performed the instant detection.In addition,100 high TG samples of hepatitis B 5-item negative and HBV-DNA non-detection and 100 whole blood samples of hepatitis B 5-item negative and HBV-DNA non-detection were collected and performed the simultaneous HBV-DNA detection of fluorescence quantitative PCR on the hyperlipemia and non-hyperlipemia specimens,hemolysis specimen and non-hemolytic serum.And the paired t test was conducted.Results The HBV-DNA detection levels had statistically significant differences between hyperlipemia and non-hyperlipemia specimens and between hemolytic serum and non-hemolytic serum (P<0.05).Conclusion The fluorescence quantitative PCR detection results of hyperlipemia and hemolysis specimens of low HBV-DNA level are reduced compared with those of instant detection for fasting collection specimens.

specimen; hemolysis; hyperlipemia; fluorescence quantitative PCR

劉小敏，男，主管檢驗技師，本科，主要從事生化檢驗、PCR檢驗。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.033

A

1672-9455(2015)21-3217-02

2015-02-18

2015-06-21)