張 帆，莫銀娟，朱麗婷(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院皮膚科，廣州 510282)

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·論 著·

3種檢測生殖器皰疹方法的對比研究

張 帆，莫銀娟，朱麗婷
(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院皮膚科，廣州 510282)

目的 尋找更為準確、經(jīng)濟、實用的生殖器皰疹病毒感染的檢測方法。方法 取根據(jù)病史及典型的臨床癥狀表現(xiàn)的生殖器皰疹疑似病例患者標本50例，分別采用病毒培養(yǎng)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 3種方法進行實驗室檢測，比較各種方法檢測的陽性率。結(jié)果 病毒培養(yǎng)陽性30例，陽性率60.0%；FQ-PCR檢測陽性34例，陽性率68.0%；ELISA檢測陽性32例，陽性率64.0%，經(jīng)χ2檢驗，三者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.69，P>0.05)。水皰和膿皰標本的陽性率分別為94.6%和83.3%，明顯高于其他來源標本的陽性率。結(jié)論 3種檢測方法對臨床疑似生殖器皰疹患者的檢測陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相對另外兩種檢測方法，ELISA因其便宜、實用的優(yōu)點而適用于臨床推廣應(yīng)用。水皰和膿皰標本陽性率明顯高于其他類型標本的陽性率，對臨床疑似病例的實驗診斷，標本以采集水皰和膿皰液為佳。

生殖器皰疹； 病毒培養(yǎng)； 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)； 酶聯(lián)免疫吸附試驗

單純皰疹病毒(HSV)包括HSV-1和HSV-2兩個血清型，HSV感染引起皰疹性口腔炎、眼炎、腦炎及生殖器炎等諸多臨床表現(xiàn)[1]。而生殖器皰疹是臨床最常見的一種性傳播疾病，具有反復發(fā)作及癌變特性，對患者的身心健康構(gòu)成嚴重威脅[2-4]。引起生殖器皰疹的主要病毒類型為HSV-2，約占90%[5]，HSV-1和混合型只占很少的一部分。本文主要研究的是檢測HSV-2感染。該病的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)，結(jié)合實驗室檢測。目前，HSV-2的實驗室診斷方法主要有病毒分離培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及血清抗體檢測等方法。其中，病毒分離培養(yǎng)為“金標準”。但病毒培養(yǎng)操作難度大，時間周期長(一般需要4～7 d)，條件要求嚴格，很難在臨床推廣。而熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測結(jié)果特異性和敏感性都高，但費用昂貴。作者采用3種檢測方法對50例生殖器皰疹臨床標本進行檢測并對比分析，以幫助找到一種適合于臨床實驗廣泛應(yīng)用的有效檢測HSV-2的方法。

1 資料與方法

1.1 標本采集 臨床疑似生殖器皰疹患者50例均來自2014年8月至2015年2月珠江醫(yī)院皮膚科門診就診患者，其中男37例，女13例；年齡19～56歲。具有臨床癥狀的患者先暴露皮損部位，采集皰液、膿皰液或潰瘍面痂面皮屑；無臨床癥狀的患者，男性采集前2 h內(nèi)未排尿，尿道口內(nèi)1～3 cm取材，女性宮頸口內(nèi)1～3 cm取材。

1.2 病毒分離培養(yǎng)

1.2.1 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)病毒細胞采用A549(肺腺癌細胞)，來自The American Type Culture Collection (ATCC)。A549使用含10%胎牛血清(Hyclone公司)的低糖DMEM培養(yǎng)液(美國Invitrogen公司)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶消化，轉(zhuǎn)至24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至單層。

1.2.2 臨床標本接種 將病毒運送液搖勻，取0.2 mL經(jīng)處理標本接種于細胞培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，以便病毒吸附，然后加入2 mL含2%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，36 ℃、5%CO2的培養(yǎng)并觀察細胞形態(tài)改變。

1.2.3 細胞觀察 將培養(yǎng)物反復凍融3次，取0.2 mL培養(yǎng)物接種到新HEP-2細胞管中，經(jīng)培養(yǎng)后，將HEP-2細胞管用吸管吹打下來，以200×g離心10 min，棄上清液，將沉淀混懸液加入100 mL、pH 7.2的PBS中，取25 mL滴于載玻片上，并涂成1 cm圓膜，干燥后，丙酮固定10 min，用HSV單克隆抗體(達科生物技術(shù)有限生物公司)染色，熒光顯微鏡觀察。

1.3 FQ-PCR檢測

1.3.1 DNA模板制備 試劑購自達安基因股份有限公司。用無菌生理鹽水洗脫拭子的分泌物或皰液。10 000×g離心10 min，棄上清液，沉淀加50 μLDNA提取液，100 ℃干浴10 min，10 000×g離心5 min，取5 μL上清液作PCR擴增模板。

1.3.2 引物設(shè)計 設(shè)計引物序列為P1：5′-AGGAGTGGCTGGCGCGACC-3′；P2：5′-ATCCGGTCCTTGATGGACG-3′。取5 μL模板提取液加入到HSV-2反應(yīng)管中，各反應(yīng)管放入LIGHTCYCLER型PCR儀中，擴增93 ℃ 2 min后93 ℃ 5 s，57 ℃ 45 s，40個循環(huán)后再37℃ 1 s。循環(huán)結(jié)束后，自動讀取定量結(jié)果值。

1.4 ELISA檢測 ELISA試劑盒購自DAKO公司?；謴椭潦覝?，取200 μL標本液加入96孔聚乙烯酸標板各反應(yīng)孔，另取陰陽性對照各200 μL加入反應(yīng)孔。各孔加酶結(jié)合物50 μL，37 ℃孵育90 min，洗滌4次，加底物A、B各100 μL，振蕩30 min，加硫酸終止液100 μL，450 nm酶標儀測A值，A>CO+0.015為陽性，表示有皰疹病毒感染。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

在50例標本中，經(jīng)病毒培養(yǎng)法檢測，30例陽性，陽性率60.0%。FQ-PCR檢測陽性34例，陽性率68.0%。ELISA檢測陽性32例，陽性率64.0%。3組檢測方法陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.69，P>0.05)。

從取材的結(jié)果類型來看，水皰和膿皰標本檢出的陽性率較高，分別為94.6%和83.3%，明顯高于其他取材類型的標本陽性率(糜爛38.8%，痂面20.0%，拭子16.6%)。見表1。

表1 50例臨床標本的病毒培養(yǎng)、FQ-PCR和ELISA的檢測結(jié)果

3 討 論

生殖器皰疹是由HSV感染泌尿生殖器及肛門周圍皮膚黏膜而引起的一種慢性、復發(fā)性、難治愈的性病，該病臨床表現(xiàn)多樣，多發(fā)且具有致癌、致畸性。近年研究發(fā)現(xiàn)，生殖器皰疹患者較健康人更易感染HIV[6-7]。臨床上典型病例可以根據(jù)病史和臨床表現(xiàn)診斷，但很多病例臨床表現(xiàn)不典型或處于亞臨床感染狀態(tài)，一些病例合并其他感染，如梅毒、尖銳濕疣及念珠菌等[8]，因此實驗室檢測對于生殖器皰疹的診斷非常必要。隨著醫(yī)學分子生物學的發(fā)展，生殖器皰疹實驗室診斷方法亦有了很大發(fā)展，病毒培養(yǎng)法、抗原檢測法、FQ-PCR及抗體檢測法等相繼應(yīng)用于HSV感染的檢測[9-10]。目前，病毒的分離培養(yǎng)法是國際公認的診斷生殖器皰疹的金標準，但操作復雜費時、技術(shù)要求高，并且分離培養(yǎng)的成功率與標本采集、標本中活病毒數(shù)量以及標本的運送和保存等多種因素有關(guān)[11]，難以成為檢測HSV-2的臨床常規(guī)方法。隨著檢測技術(shù)的進步，F(xiàn)Q-PCR逐漸取代傳統(tǒng)的PCR檢測法。FQ-PCR由于多使用了一條與模板互補配對的核酸探針，因此比傳統(tǒng)PCR法具有更高敏感性和特異性[12]，同時減少了假陽性的概率。但FQ-PCR所需檢測儀器價格昂貴，實驗場所要求必須達到國家規(guī)定的PCR實驗室條件，且實驗操作人員必須經(jīng)嚴格的崗前培訓并具有相應(yīng)的資質(zhì)。而ELISA方法具有方便、快速及費用低等有點，且實驗條件要求不高。國外研究證實，ELISA(DAKO試劑盒)檢測皰疹病毒抗原有較高的敏感性和特異性[13]。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)3種檢測方法對HSV-2的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示用相對簡單的ELISA代替其他兩種方法檢測HSV-2的可行性。本試驗中，還發(fā)現(xiàn)不同的標本來源，檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中水皰和膿皰的標本陽性率明顯高于其他類型的標本，提示水皰和膿皰中病毒的活力最強或處于病毒復制期，而其他類型標本中的活力明顯減弱甚至消失。提示實驗室檢測生殖器皰疹，標本的采集最好為水皰或膿皰的皰液。

[1]周翠，曹春來，樊建勇，等.單純皰疹病毒2型全長糖蛋白D抗原的原核表達及抗原性 分析[J].實用醫(yī)學雜志，2008,24(10):1668-1670.

[2]Jones CA,Isaacs D.Management of herpes simplex virus infections [J].Current Paediatrics,2004,14(2):131-136.

[3]Sanchez-Alemán MA,Conde-Glez CJ,Gayet C,et al.Sexual Behavior and Herpes Simplex Virus 2 Infection in College Students [J].Arch Med Res,2005,36(5):574-580.

[4]Avgil M,Ornoy A.Herpes simplex virus and Epstein-Barr virus infections in pregnancy:consequences of neonatal or intrauterine infection [J].Reprod Toxicol,2006,21(4):436-445.

[5]賴偉紅，馮蓮風，韓國柱，等.生殖器潰瘍中單純皰疹病毒的檢測和分型[J].中國麻風皮膚病雜志，2003,19(1)：13-15.

[6]Martinelli E,Tharinger H,Frank I,et al.HSV-2 infection of dendritic cells amplifies a highly susceptible HIV-1 cell target [J].PLoS Pathog，2011,7(6):e1002109.

[7]Mujugira A,Magaret AS,Baeten JM,et al. Risk factors for HSV-2 infection among sexual partners of HSV-2/HIV-1 co-infected persons[J].BMC Res Notes,2011,4:64-69.

[8]賴偉紅，韓國柱，王千秋.生殖器皰疹合并其他性傳播感染的臨床研究[J].中華皮膚科雜志，2002,35(3):209-211.

[9]秦運軍，孫文會，鄭艷姬，等．FQ-PCR、ELISA 檢測生殖器皰疹患者HSV-2 相關(guān)指標結(jié)果分析[J]．山東醫(yī)藥，2009,49(38):76.

[10]陳戴紅，毛會軍，邱建萍，等．電化學發(fā)光法檢測單純皰疹病毒2 IgG抗體應(yīng)用評估[J]．檢驗醫(yī)學，2012,27(11):887-889.

[11]Schmutzhard J,Riedel HM,Zweygberg B,et al.Detection of herpes simplex virus typel,herpes simplex virus type 2 and varicellazoster virus in skin lesions.Comparsion of real-time PCR,nested PCR and virus isolation [J].J Clin Virol,2004,29(2):120-126.

[12]楊帆，李永雙.熒光定量PCR儀檢女性商業(yè)性性工作者性傳播感染[J].中國麻風皮膚病雜志，2004,12(4)：334-335.

[13]Brinker JP,Herrmann JE.Comparison of three monoclonal antibody-based enzyme immunoassays for detection of herpes simplex virus in clinical specimens [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1995,14(4):314-317.

Contrastive study on three methods in detection of genital herpes virus

ZHANGFan,MOYin-juan,ZHULi-ting
(DepartmentofDermatology,ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510282,China)

Objective To search for a more accurate,economic and practical detection method of genital herpes virus (HSV).Methods 50 specimens were collected from the suspected as genital herpes according to the disease history and the typical clinical symptoms and tested by adopting 3 kinds of method:virus culture method，fluorescence quantitative-PCR (FQ-PCR) and ELISA.The positive rates were compared among 3 kinds of method.Results 30 cases were positive in the virus culture,the positive rate was 60.0%,34 cases were positive in FQ-PCR with the positive rate of 68.0%,32 cases were positive in ELISA with the positive rate of 64.0%,the differences were not statistically significant(χ2=0.69，P>0.05).However,the positive rates of blister and pustules specimens were 94.6% and 83.3% respectively,which were significantly higher than those of other sources of samples.Conclusion The positive rate of clinically suspected genital herpes detected by using three methods had no statistically significant difference.ELISA is more suitable for clinical application compared with other two methods because of cheap and convenient advantages.The positive rate of blister and pustules specimens is significantly higher than that of other types of samples,therefore in the laboratory diagnosis for the suspected case,collecting the blister and pustules samples is best.

genital herpes； virus culture； FQ-PCR； ELISA

張帆 男，副主任技師，碩士，主要從事皮膚性病檢驗和腫瘤病理研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.019

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1672-9455(2015)21-3182-02

2015-04-29

2015-06-24)