黃小麗，趙瑞珂，李艷萌，余佳佳，張險峰，錢雪峰，韓清珍，徐 杰△(1.江蘇省宿遷市泗洪縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 3900；.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科/江蘇省臨床免疫研究所，江蘇蘇州 15006)

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·論 著·

醫(yī)院獲得性尿路感染腸球菌耐藥性與毒力基因型相關(guān)研究*

黃小麗1,2，趙瑞珂2，李艷萌2，余佳佳2，張險峰2，錢雪峰2，韓清珍2，徐 杰2△
(1.江蘇省宿遷市泗洪縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 223900；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科/江蘇省臨床免疫研究所，江蘇蘇州 215006)

目的 研究醫(yī)院獲得性尿路感染腸球菌毒力因子和耐藥分布，以及兩者間的關(guān)系，為臨床合理使用抗菌藥物和控制感染提供依據(jù)。方法 分離出臨床尿路感染標(biāo)本中74株腸球菌進(jìn)行菌株鑒定，采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)做藥物敏感試驗(yàn)；PCR檢測cylL-L、cylL-S、cylL-A、esp、acm、gelE、asa-I、cpd、ace毒力基因。結(jié)果 74株腸球菌中有糞腸球菌45株(60.8%)，屎腸球菌29株(39.2%)。屎腸球菌對青霉素G、氨芐西林、環(huán)丙沙星耐藥率分別為89.66%、89.66%、79.31%，明顯高于糞腸球菌。糞腸球菌對慶大霉素120、四環(huán)素耐藥率分別為46.67%、53.33%，略高于屎腸球菌。cylL-L、cylL-S、cylL-A、esp、acm、gelE、asa-I、cpd、ace毒力基因的陽性率分別為24.32%、44.59%、22.97%、44.59%、60.81%、22.97%、25.67%、22.97%、9.46%。屎腸球菌毒力基因分布與耐藥性間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 糞腸球菌是醫(yī)院獲得性尿路感染的主要腸球菌，屎腸球菌表現(xiàn)為多重耐藥，糞腸球菌攜帶更多的毒力因子，屎腸球菌毒力基因數(shù)與耐藥性之間密切相關(guān)，臨床應(yīng)注意抗菌藥物的合理應(yīng)用，防止腸球菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播。

尿路感染； 屎腸球菌； 糞腸球菌； 毒力基因； 耐藥性

尿路感染(UTI)是在住院患者中最常見的院內(nèi)感染，并且大部分的泌尿道感染都與腸球菌有關(guān)，這與尿路器械操作、留置導(dǎo)尿、尿路結(jié)構(gòu)異常有關(guān)，是重要的醫(yī)院感染病原菌。腸球菌屬共包括18個菌屬，從人類分離到的主要是糞腸球菌和屎腸球菌兩種，在臨床上可以引起不同部位的感染，以呼吸道感染率最高(30.7%)，泌尿系統(tǒng)次之(29.2%)[1]。由于臨床上抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致多重耐藥菌株廣泛流行，給臨床的治療帶來困難。本研究對醫(yī)院獲得性尿路感染腸球菌耐藥和毒力基因型的分布及相互關(guān)系進(jìn)行研究，為臨床合理使用抗菌藥物和控制感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 選擇2013年10月至2014年9月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者(住院時間不低于7 d)的尿路感染標(biāo)本中分離的腸球菌，共74株。同一患者同類標(biāo)本同一時期分離到的同種菌株不重復(fù)計(jì)入。

1.1.2 鑒定與藥物敏感試驗(yàn) 分離出的細(xì)菌均經(jīng)法國Bio-Merieux公司VITEK Ⅱ Compact鑒定，保存于-70 ℃。有效期內(nèi)用于抗菌藥物體外敏感試驗(yàn)的藥物敏感試驗(yàn)紙片：青霉素G(P)、萬古霉素(VAN)、環(huán)丙沙星(CIP)、替考拉寧(TEC)、氨芐西林(AMP)、慶大霉素120(CN)、四環(huán)素(TET)、利奈唑胺(LZD)，均購自英國OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)，結(jié)果參照2011版美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，對74株尿路感染腸球菌進(jìn)行藥物敏感性判定。

1.2.2 DNA模板的制備 水煮法制備DNA模板，99 ℃，煮10 min，12 000 r/min，離心5 min，取上清液作為PCR模板，-20 ℃放置備用。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及條件 反應(yīng)體系25 μL，進(jìn)行30個循環(huán)，退火溫度、擴(kuò)增長度及引物序列見表1。cylL-L、cylL-S、cylL-A、esp、acm、gelE、asa-I、cpd、ace基因的引物[2-4]均由華大基因有限公司合成。PCR產(chǎn)物凝膠電泳根據(jù)條帶長度進(jìn)行判定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 Excel 2010與IBM SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)分析，菌株耐藥統(tǒng)計(jì)分析時設(shè)定為“1”，敏感設(shè)定為“0”；毒力基因有為“1”，無為“0”。利用SPSS 21.0軟件雙變量相關(guān)性分析，對分離株的多種藥耐藥率和毒力基因數(shù)關(guān)系進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腸球菌對8種常見抗菌藥物耐藥情況 74株腸球菌分離出45株糞腸球菌(60.8%)和29株屎腸球菌(39.2%)，兩種腸球菌對8種常見抗菌藥物顯示出差異性的耐藥率，見表2。屎腸球菌對青霉素G、氨芐西林、環(huán)丙沙星高度耐藥，耐藥率依次為89.66%、89.66%、79.31%；糞腸球菌對慶大霉素120、四環(huán)素耐藥率略高于屎腸球菌；74株腸球菌對萬古霉素、利奈唑胺和替考拉寧全敏感。

2.2 腸球菌分離株毒力基因分布 毒力基因分布結(jié)果顯示：74株腸球菌毒力基因cylL-L、cylL-S、cylL-A、esp、acm、gelE、asa-I、cpd、ace的總陽性率分別為24.32%、20.27%、22.97%、44.59%、60.81%、13.51%、25.67%、22.97%、9.46%(表3)。除了esp、acm兩毒力基因的陽性率是屎腸球菌大于糞腸球菌，其余毒力基因的陽性率均是糞腸球菌大于屎腸球菌。74株腸球菌中acm基因攜帶率最高，為60.81%，esp次之為44.59%，ace攜帶率最低。統(tǒng)計(jì)分析顯示，糞腸球菌和屎腸球菌不同毒力基因的檢出率之間除了gelE、ace、esp毒力基因差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。74株腸球菌中含有一種毒力基因或多種不同毒力基因，其構(gòu)成比見表4；含有一種毒力基因比率最高為41.89%(31/74)，含有兩種的毒力基因的比率次之(19/74)，含有4種毒力基因的比率最少為2.70%(2/74)。

2.3 毒力基因分布與耐藥性之間的關(guān)系 毒力基因分布與耐藥性關(guān)系SPSS 21.0軟件雙變量相關(guān)性分析結(jié)果顯示，屎腸球菌毒力基因分布數(shù)與耐藥性間呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r)為-0.601，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明：屎腸球菌毒力基因分布數(shù)越多的菌株，出現(xiàn)多重耐藥的概率就越小，即其耐藥性降低。糞腸球菌毒力基因分布數(shù)與耐藥性間的r為0.086，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.086)，糞腸球菌攜帶毒力基因數(shù)的多少與抗菌藥物的耐藥性之間不存在關(guān)聯(lián)。

表1 本研究所用的引物

表2 尿路感染的糞腸球菌與屎腸球菌的耐藥率

續(xù)表2 尿路感染的糞腸球菌與屎腸球菌的耐藥率

注：-表示未統(tǒng)計(jì)。

表3 腸球菌毒力基因分布

表4 74株腸球菌不同毒力基因構(gòu)成比

3 討 論

腸球菌廣泛分布于自然界中，是健康人上呼吸道和腸道的常居菌，也是近年醫(yī)院感染的常見病原菌。本研究分離出長期住院患者(≥7 d)尿路感染74株腸球菌，其中糞腸球菌45株(60.8%)，屎腸球菌29株(39.2%)，與國內(nèi)臨床上報道的糞腸球菌分離率(60%～70%)高于屎腸球菌(30%～40%)的結(jié)果基本相一致[5-7]。

腸球菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示：腸球菌對青霉素類耐藥率最高，達(dá)65.75%，對糖肽類和噁唑烷酮類則100%敏感。腸球菌對糖肽類高水平耐藥，自1988年就有報道，并已在全球范圍內(nèi)逐漸播散。本試驗(yàn)未分離出耐萬古霉素腸球菌(VRE)，說明本地區(qū)的腸球菌還對糖肽類抗菌藥物保持高度敏感性。醫(yī)院感染中常見的糞腸球菌和屎腸球菌有著不同的耐藥特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌對青霉素G、氨芐西林、環(huán)丙沙星高度耐藥，耐藥率分別為89.66%、89.66%、79.31%；糞腸球菌對慶大霉素120、四環(huán)素耐藥率略高于屎腸球菌；本試驗(yàn)結(jié)果與全國結(jié)果相近[8]。

腸球菌具有一系列特異性毒力因子，常常由位于染色體上的致病島基因編碼[9]。這些毒力基因有助于細(xì)菌突破宿主的免疫防御系統(tǒng)，定植于泌尿道甚至侵入尿道上皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致泌尿道感染[10]。腸球菌毒力基因中，acm分離率最高，為60.81%，屎腸球菌中acm分布率達(dá)86.21%。esp基因分離率次之，為44.59%，屎腸球菌中esp基因分布率達(dá)58.62%。除了這兩毒力基因的分離率是屎腸球菌多于糞腸球菌外，其余均是糞腸球菌多于屎腸球菌。屎腸球菌的acm基因會表達(dá)一種固定在細(xì)胞壁上的膠原蛋白黏附素-Acm蛋白，Acm相關(guān)的Ⅰ型的膠原蛋白的黏附能力，被認(rèn)為與屎腸球菌的臨床侵襲性高度相關(guān)[1]。這種基因的高攜帶率為腸球菌黏附、定植于尿道中提供了依據(jù)。esp基因被證實(shí)與毒力增強(qiáng)和生物被膜的形成有關(guān)[1]。細(xì)菌生物膜在慢性和遷延性感染中起著重要的作用[11]。

cylL-L、cylL-S、cylL-A這3種基因?yàn)槿苎鼗?，該基因位于質(zhì)粒或染色體上的致病島區(qū)域，編碼腸球菌溶血素，其產(chǎn)生過程很復(fù)雜[12]。糞腸球菌的cylL-L、cylL-S、cylL-A溶血素基因陽性率分別為33.33%、28.89%、33.33%，遠(yuǎn)高于屎腸球菌的10.34%、6.90%、6.90%。這也與分離出的糞腸球菌大部分有β溶血環(huán)有關(guān)。

gelE基因編碼明膠酶E，該酶是一種Zn金屬蛋白酶，可以酶解宿主細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)中的膠原蛋白，與腸球菌向周圍感染有關(guān)[13]。本研究中g(shù)elE基因在糞腸球菌中的陽性率遠(yuǎn)大于屎腸球菌，這與國外部分研究報道結(jié)果一致[14-15]。也有關(guān)于屎腸球菌中g(shù)elE基因陽性率較低的報道[16]，也曾有報道屎腸球菌中未分離出gelE基因[17]。

asa-I、cpd、ace基因分別與編碼聚集物質(zhì)、性激素類物質(zhì)、黏膠蛋白有關(guān)。本研究中分離出此3種基因的陽性率糞腸球菌明顯高于屎腸球菌。這也與國際上的一些學(xué)者做出的結(jié)果相一致[18-20]。雖然有學(xué)者認(rèn)為，ace基因可以作為針對人尿路感染的一個藥物治療靶點(diǎn)[21]，但是本研究結(jié)果顯示ace的P值為0.534，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

耐藥數(shù)與毒力基因數(shù)之間的相關(guān)性顯示：屎腸球菌毒力基因數(shù)與耐藥性之間呈負(fù)相關(guān)。屎腸球菌越耐藥，攜帶的毒力基因數(shù)越少。這可能和PAIs基因突變，毒力基因減少，細(xì)菌的致病性減弱，低致病性菌株可以更長時間在免疫力低下的人中定植或共棲存在，從而增加細(xì)菌獲得耐藥基因的概率。糞腸球菌毒力基因分布數(shù)與耐藥性間的r為0.086，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明糞腸球菌攜帶毒力基因數(shù)的多少與抗菌藥物的耐藥性之間不存在關(guān)聯(lián)。這與國內(nèi)祝進(jìn)等[22]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，醫(yī)院獲得性尿路感染性腸球菌中糞腸球菌感染多于屎腸球菌感染。糞腸球菌毒力基因分布大于屎腸球菌，進(jìn)一步證實(shí)了該菌在尿路感染中的地位。屎腸球菌中的毒力基因數(shù)與耐藥性之間密切相關(guān)，尿路感染腸球菌分離出的屎腸球菌大多表現(xiàn)為多重耐藥，這與抗菌藥物的選擇壓力下耐藥性相關(guān)質(zhì)粒的獲得與丟失有關(guān)。屎腸球菌中acm、esp基因分離率最高，增強(qiáng)了屎腸球菌在尿路中的黏附、定植與遷延能力，引起醫(yī)院獲得性尿路感染，易于在院內(nèi)傳播和擴(kuò)散。所以醫(yī)院要關(guān)注和加強(qiáng)腸球菌的耐藥與毒力基因攜帶情況的監(jiān)測，規(guī)范、合理使用抗菌藥物，防止耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播。

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Correlation of drug resistance with virulence genotypes of Enterococcus in hospital acquired urinary tract infection*

HUANGXiao-li1,2,ZHAORui-ke2,LIYan-meng2,YUJia-jia2,ZHANGXian-feng2,QIANXue-feng2,HANQing-zhen2,XUJie2△
(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SihongCountyPeople′sHospital,Suqian,Jiangsu223900;2.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofSuzhouUniversity/JiangsuProvincialResearchInstituteofClinicalImmunology,Suzhou,Jiangsu215006,China)

Objective To investigate the distribution of virulence factors and drug resistance of Enterococcus in hospital-acquired urinary tract infections,and their correlation to provide the basis for rationally using antibacterial drugs and controlling infection.Methods 74 strains of Enterococcus isolated from clinical specimens of urinary tract infection were performed the bacterial strain identification and the antimicrobial susceptibility test was conducted by the K-B method.Virulence genes of cylL-L,cylL-S,cylL-A,esp,acm,gelE,asa-I,cpd and ace were detected by PCR.Results Among 74 strains of enterococcal,45(60.8%) strains and 29(39.2%) strains were E.faecalis and E.faecium,respectively.The resistance rates of Enterococci isolates to penicillin G,ampicillin and ciprofloxacin were 89.66%,89.66% and 79.3%,which were significantly higher than that of E.faecalis.Among E.faecalis,the resistance rate was 46.67% to gentamicin,53.33% to tetracycline,which were slightly higher than that of E.faecium.The positive rates of cylL-L,cylL-S,cylL-A,esp,acm,gelE,asa-1,cpd，ace were 24.32%,44.59%,22.97%,44.59%,60.81%,22.97%,25.67%,22.97% and 9.46%,respectively.A significant correlation was found between distribution of virulence genes and antimicrobial resistance of E.faecium(P<0.05).Conclusion E.faecalis is the predominant species in hospital-acquired urinary infection;the majority of E.faecium was multidrug-resistant;E.faecalis has more virulence genes than E.faecium.There is a close relationship between the virulence genes and the drug resistance.Thus it is necessary for clinic to pay attention to the reasonable use of antibacterial drugs so as to prevent the emergence and spread of Enterococcus.

urinary tract infections; E.faecium; E.faecalis; virulence gene; drug resistance

江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(Q201401)；江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項(xiàng)目(KYLX-1261)；蘇州市“科教興衛(wèi)”青年課題項(xiàng)目(kjxw2014008)。

黃小麗，女，碩士，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床細(xì)菌耐藥與致病機(jī)制研究。△

，E-mail:xuj2007@lzu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.004

A

1672-9455(2015)21-3140-04

2015-03-15

2015-08-14)