李 冠，夏 振

(1. 湖北省襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021；2. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250031)

姜黃素對大鼠腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的作用研究

李 冠1，夏 振2

(1. 湖北省襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021；2. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250031)

目的 探討姜黃素對大鼠腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的作用，為姜黃素的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。方法 選取40只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對照組、模型組、姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組。除對照組外,其他3組采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型。在制作缺血模型前15 min，姜黃素低劑量組給予10 mg/kg姜黃素制劑腹腔注射，姜黃素高劑量組給予50 mg/kg姜黃素制劑腹腔注射，模型組給予相同體積的玉米油腹腔注射。手術(shù)后24 h對所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，然后斷頭取腦組織進(jìn)行腦組織髓過氧化物酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9和伊文思藍(lán)容量水平、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、NF-κB p65水平測定及腦梗死體積的測定。結(jié)果 模型組、姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組的腦組織髓過氧化物酶活性、神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦梗死體積、MMP-2、MMP-9、伊文思藍(lán)容量、TNF-α和NF-κB p65均顯著高于對照組(P均<0.05),而姜黃素低劑量組及姜黃素高劑量組均顯著低于模型組(P均<0.05)，且姜黃素高劑量組優(yōu)于姜黃素低劑量組(P<0.05)。結(jié)論 姜黃素能夠明顯改善大鼠腦缺血再灌注引起的損傷，其藥效機(jī)制可能與抑制NF-κB、TNF-α、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)系。

姜黃素；腦缺血再灌注損傷；血腦屏障

隨著人類生活方式的改變，腦血管疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且此類疾病致死、致殘率高，嚴(yán)重威脅人類生命健康。臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：80%腦血管疾病屬于缺血性病變[1]，除缺血本身外，缺血恢復(fù)血供后大量自由基聚集、過度炎性反應(yīng)等系列復(fù)雜的病理過程都會(huì)使腦組織發(fā)生繼發(fā)性損傷，從而進(jìn)一步加重腦組織的免疫炎癥反應(yīng)、血管源性水腫和出血，破壞血腦屏障[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥提取物或復(fù)方對缺血性腦血管疾病和繼發(fā)損傷有很好的治療效果，但對其中大多數(shù)藥物的藥效機(jī)制不甚明確。筆者以腦缺血再灌注損傷大鼠為模型動(dòng)物，對中藥提取物姜黃素對腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)和血腦屏障的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1主要試劑和動(dòng)物

1.1.1主要試劑 選擇南京廣潤生物制品有限公司所研制的高純度姜黃素，使用0.5 mol/L的氫氧化鈉進(jìn)行溶解，將其稀釋為100 g/L的溶液，冷藏在-20 ℃的環(huán)境中，在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)實(shí)際情況再次進(jìn)行稀釋。伊文思藍(lán)染料購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，腦組織髓過氧物酶試劑盒、兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)多克隆抗體、兔抗大鼠MMP-9多克隆抗體、鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒購自美國RD公司，NF-κB p65多克隆抗體、免疫組化二抗染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雄性，共40只，體質(zhì)量250～300(270±20)g,由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(魯)20110002。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組 將實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、模型組、姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組，每組10只。

1.2.2腦缺血模型的制備 除對照組外,其他3組采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型。方法：腹腔麻醉后，分離頸總動(dòng)脈套線，電針灼燒雙側(cè)椎動(dòng)脈，縫合后24 h于頸部正中切口，同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成腦缺血狀態(tài)20 min，然后松開雙側(cè)動(dòng)脈夾恢復(fù)腦血流灌注，對照組除不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余操作與另外3組一致。在制作缺血模型前15 min，姜黃素低劑量組給予10 mg/kg姜黃素制劑(藥物用玉米油稀釋至10 mg/mL)腹腔注射，姜黃素高劑量組給予50 mg/kg姜黃素制劑(藥物用玉米油稀釋至50 mg/mL)腹腔注射，模型組給予相同體積的玉米油腹腔注射。

1.3觀察指標(biāo)及測量方法 全部大鼠于手術(shù)后23 h經(jīng)尾靜脈注射伊文思藍(lán)，24 h大鼠清醒后，首先對所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，然后將大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開右心耳同時(shí)向左心室注入4 ℃肝素鈉，待右心耳流出清澈液體時(shí)表示灌注完成。斷頭取出大鼠腦組織，將大鼠大腦部分受損區(qū)域分離剪碎放入離心管中，滴加PBS后以4 500 r/min離心10 min后，取勻漿備用。另一部分受損腦組織通過切片染色進(jìn)行腦梗死體積的測定。

1.3.1腦組織髓過氧化物酶檢測 取上述勻漿100 mg，按照腦組織髓過氧化物酶試劑的說明書具體步驟進(jìn)行操作，即可算出腦組織髓過氧化物酶活性[2]。

1.3.2MMP-2、MMP-9水平測定 取上述勻漿100 mg，經(jīng)過蛋白裂解后提取總蛋白，通過灌膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗(兔抗大鼠MMP-9多克隆抗體、鼠抗大鼠β-actin 單克隆抗體)4 ℃孵育過夜，再加入二抗室溫孵育2 h，發(fā)光得到MMP-2、MMP-9 Western blot結(jié)果。

1.3.3伊文思藍(lán)容量水平測定 取上述勻漿100 mg，與50%的三氯醋酸均勻混合，靜置24 h，紫外分光光度法測定出伊文思藍(lán)溶液的具體數(shù)值，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算出伊文思藍(lán)容量水平。

1.3.4TNF-α和NF-κB p65水平測定 取上述勻漿100 mg，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定同一時(shí)間點(diǎn)大鼠缺血腦組織的TNF-α水平，采用Western blot方法測定NF-κB p65水平。

1.3.5腦梗死體積測定 取出大鼠的部分受損腦組織，根據(jù)管狀面組織進(jìn)行大腦切片，厚度保持在2 mm。將其放入TTC染色液中靜置20 min，20 min后再將大腦切片放置在10%福爾馬林溶液中靜置24 h。如果是正常的腦組織顏色為鮮紅色，腦梗死的腦組織顏色為白色。使用IPP圖像分析軟件具體測量出每一片大腦切片的梗死面積，從而計(jì)算整個(gè)大腦的腦梗死體積。

1.4神經(jīng)功能損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 無神經(jīng)功能障礙為0分；抓起大鼠的尾巴，如果其前肢彎曲計(jì)1分；行走過程中在地上不停打轉(zhuǎn)，停止后身體不偏向?qū)?cè)計(jì)2分；行走過程中在地上不停打轉(zhuǎn)，停止后身體偏向?qū)?cè)計(jì)3分；嚴(yán)重意識(shí)障礙計(jì)4分。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織髓過氧化物酶活性、神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積比較 模型組、姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組腦組織髓過氧化物酶活性、神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積均顯著高于對照組(P均<0.05)；姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組腦組織髓過氧化物酶活性、神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積均顯著低于模型組(P均<0.05)，且姜黃素高劑量組低于姜黃素低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦組織髓過氧化物酶活性、神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積比較

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與姜黃素低劑量組比較，P<0.05。

2.2各組MMP-2、MMP-9和伊文思藍(lán)容量水平比較 模型組、姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組MMP-2、MMP-9和伊文思藍(lán)容量水平均顯著高于對照組(P均<0.05)；姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組MMP-2、MMP-9和伊文思藍(lán)容量水平均顯著低于模型組(P均<0.05)，且姜黃素高劑量組低于姜黃素低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組MMP-2、MMP-9和伊文思藍(lán)容量水平比較

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與姜黃素低劑量組比較，P<0.05。

2.3各組TNF-α和NF-κBp65水平比較 模型組、姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組TNF-α和NF-κBp65水平均顯著高于對照組(P均<0.05)；姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組TNF-α和NF-κBp65水平均顯著低于模型組(P均<0.05)，且姜黃素高劑量組低于姜黃素低劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 各組TNF-α和NF-κB p65水平比較

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與姜黃素低劑量組比較，P<0.05。

3 討 論

缺血性腦血管病及再灌注損傷是一種高致死、致殘性疾病，患者多數(shù)預(yù)后不良，對患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，不僅給患者帶來極大的身心創(chuàng)傷，也給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵是在盡早恢復(fù)腦組織正常供血的同時(shí)減少或避免再灌注損傷腦組織帶來的二次創(chuàng)傷[3-4]。當(dāng)前對腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制研究結(jié)果有氧自由基聚集、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過度、線粒體損傷、免疫炎癥等學(xué)說[5]，其中過度炎性反應(yīng)被認(rèn)為是損傷產(chǎn)生的重要原因。NF-κB是炎癥反應(yīng)過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，作用于炎癥的中心環(huán)節(jié)，在腦缺血再灌注損傷中受氧自由基、鈣超載等因素刺激活化后，迅速從細(xì)胞漿移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合啟動(dòng)子序列上特異位點(diǎn)，從而啟動(dòng)炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1的轉(zhuǎn)錄。TNF-α是發(fā)生腦缺血再灌注時(shí)受損腦細(xì)胞和浸潤的免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子之一，它通過介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中ICMA-1和主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類分子的表達(dá)、促進(jìn)白細(xì)胞浸潤和血腦屏障破壞對神經(jīng)元細(xì)胞造成損傷；有研究通過小鼠TNF-α基因敲除后進(jìn)行腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)證明，敲除該基因的小鼠腦組織梗死體積明顯比對照組小，這說明TNF-α可能有神經(jīng)毒害作用[6]。

血腦屏障損傷發(fā)生于腦缺血再灌注后，血腦屏障正常通透性發(fā)生異常進(jìn)而引發(fā)腦水腫。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白質(zhì)，它們是鋅離子依賴的蛋白酶，能夠降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分[7]。MMP-2和MMP-9是MMPs蛋白質(zhì)家族2種十分重要的酶，通過直接降解蛋白破壞血腦屏障[8-9]。對MMP-2和MMP-9與缺血性腦損傷后血腦屏障的破壞關(guān)系的研究報(bào)道證明，大量的MMP-2和MMP-9表達(dá)在缺血性腦損傷患處表達(dá)，而上述兩種酶在外周血和未受損部位表達(dá)則無異常，而通過應(yīng)用MMPs抑制劑和基因沉默方式發(fā)現(xiàn)抑制MMPs對腦再灌注損傷有重要的治療作用[10-11]。

姜黃素是一種從姜黃屬藥用植物中提取的黃顏色多酚物質(zhì)，其有多種生物學(xué)功能，包括清除自由基、抗腫瘤、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化和抗炎癥等作用。紀(jì)風(fēng)濤等[12]報(bào)道，姜黃素可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后的腦梗死體積和腦水腫程度，改善大鼠的行為學(xué)評(píng)分。楊克紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過增加腦缺血再灌注損傷腦組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及原肌球蛋白受體激酶B(TrkB)蛋白表達(dá)，增加BDNF蛋白合成及其與其特異性受體TrkB相結(jié)合量，產(chǎn)生對缺血神經(jīng)元起保護(hù)作用的效應(yīng)分子，從而發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷24h后，模型組、姜黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組大鼠腦組織髓過氧化物酶活性、神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦梗死體積，TNF-α、NF-κBp65、MMP-2、MMP-9和伊文思藍(lán)容量水平均顯著高于對照組，黃素低劑量組以及姜黃素高劑量組各指標(biāo)均顯著低于模型組，且隨著劑量升高效果更加明顯，說明缺血再灌注造成一定的炎癥反應(yīng)和血腦屏障損傷，而姜黃素可以使腦缺血再灌注后受損腦組織炎性反應(yīng)程度、血腦屏障損傷程度降低。

綜上所述，姜黃素能夠明顯改善大鼠腦缺血再灌注引起的損傷，其藥效機(jī)制可能與抑制NF-κB、TNF-α、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)系。

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Study on the effect of ourcumin on inflammation actions and blood-brain barrier permeability in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury

LI Guan1, XIA Zhen2

(1.The Central Hospital of Xiangyang City, Xiangyang 441021, Hubei, China; 2.The Affiliated Hospital of Medical Science Academy of Shandong Province, Jinan 250031, Shandong, China)

Objective It is to analyze and discuss the effect of curcumin on inflammation actions and blood-brain barrier permeability in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury, thus to provide a theoretical basis for the applications of this medicine. Methods 40 male SD rats were selected and randomly divided into control group, model group, low and high dosage of curcumin groups. The rats in all the groups except control group were made into ischemia/reperfusion injury models by suture method. At 15min before model establishing, low and high dosage of curcumin groups were respectively given 10 mg/kg and 50 mg/kg curcumin by intraperitoneal injection, model group was given the same volume of maize oil by intraperitoneal injection. In 24 hours after cerebral ischemia neurological severity scores of all the rats were evaluated, then the heads of the rats were cut off and and brain tissue was gotten to determine the levels of myeloperoxidase,matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9 and Evans Blue capacity, TNF-α and NF-κB p65, neurological damage score and infarct volume were evaluated too. Results Myeloperoxidase activity, neurological injury score, infarction volume, MMP-2, MMP-9, Evans Blue capacity, TNF-α and NF-κB p65 were significantly higher in model group and curcumin groups than that in control group (P<0.05), and the indexes above in curcumin groups were significantly lower than that in the model group, and the indexes in high dosage of curcumin group were lower than that in low dosage group (P<0.05). Conclusion Curcumin can effectively relieve the damage caused by cerebral ischemia and reperfusion in rats, and the pharmacodynamics mechanism may be related with its inhibition of the expression of TNF-α and NF-κB, MMP-2 and MMP-9.

curcumin; cerebral ischemia/reperfusion injury; blood-brain barrier

李冠，男，主管藥師，主要從事藥理學(xué)研究工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.08.006

R-332

A

1008-8849(2015)08-0814-04

2014-10-16