劉金鳳

(河北省豐寧縣醫(yī)院，河北 豐寧 068350)

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎小鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用

劉金鳳

(河北省豐寧縣醫(yī)院，河北 豐寧 068350)

目的 探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對呼吸道合胞病毒(RSV)毛細(xì)支氣管炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，為毛細(xì)支氣管炎的治療提供新的思路和依據(jù)。方法 采用RSV鼻腔接種法制作毛細(xì)支氣管炎小鼠模型；通過貼壁培養(yǎng)法體外分離純化擴增BMSCs，使用第3代(P3)BMSCs作為實驗細(xì)胞；將60只3周BALB/C小鼠隨機分成模型組、BMSCs組、磷酸緩沖液(PBS)組、健康組，每組15只，BMSCS治療組和PBS組分別經(jīng)尾靜脈注射BMSCs和PBS，24 h后處置，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg和Th17細(xì)胞百分率；收集外周血和肺泡灌洗液(BALF)，ELISA法檢測IL-4、IFN-γ、IL-10、TGF-β和IL-17細(xì)胞因子表達(dá)水平。結(jié)果與健康組相比，模型組Treg百分率降低，Th17百分率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)；與模型組相比，BMSCs組Treg百分率升高，Th17百分率下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。模型組IL-4、IL-17水平高于健康組(P均<0.05)，IFN-γ、IL-10、TGF-β水平低于健康組(P均<0.05)；BMSCs組IL-4、IL-17水平明顯低于模型組(P均<0.05)，IL-10、TGF-β水平明顯高于模型組(P均<0.05)，IL-17表達(dá)水平顯著高于健康組(P<0.05)；BMSCs組IL-10、TGF-β表達(dá)水平高于模型組(P均<0.05)。結(jié)論 BMSCs對RSV毛細(xì)支氣管炎小鼠模型有積極的免疫調(diào)節(jié)作用，通過糾正Th1/Th2和Treg/Th17失衡，達(dá)到治療毛細(xì)支氣管炎的作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；毛細(xì)支氣管炎；細(xì)胞因子；免疫調(diào)節(jié)

毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒常見的呼吸道疾病，且多發(fā)生于2歲以內(nèi)的小兒，多由呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起[1]。臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)作性喘憋、咳嗽和“三凹征”，常伴有呼氣相哮鳴音和低熱。目前研究認(rèn)為其是一種特殊類型的肺炎，也稱之為喘憋性肺炎。臨床中多采用白三烯調(diào)節(jié)劑、沙丁胺醇、布地奈德或靜脈注射糖皮質(zhì)激素治療，尚無安全有效的疫苗和特效藥物。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是來源于中胚層的一類具有自我更新及多向分化能力的干細(xì)胞，是近年來干細(xì)胞領(lǐng)域研究熱點之一。因其具有炎癥部位聚集和趨向性，故可能對治療RSV毛細(xì)支氣管炎有一定作用。本研究探討了BMSCs對RSV毛細(xì)支氣管炎小鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗資料

1.1材料 SPF級、3周BALB/C小鼠，雌雄不拘，體質(zhì)量14～15 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2006-0009。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科技部2006年頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要試劑及儀器 胎牛血清(FBS)、細(xì)胞培養(yǎng)液L-DMEM(美國Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，熒光標(biāo)記抗鼠抗體(美國BD公司)，流式細(xì)胞儀(美國Coulter-Elite公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)，小鼠外周血單核細(xì)胞分離液(上海博耀生物科技有限公司)。

1.3小鼠BMSCs的分離與培養(yǎng)(貼壁分離法) 小鼠脫頸處死，于75%乙醇中浸泡3～4 min，無菌狀態(tài)下取雙側(cè)股骨放在裝有L-DMEM培養(yǎng)液的玻璃皿中，用無菌紗布擦去肌肉，培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，再用剪刀剪開骨兩端，用1 mL一次性無菌注射器沖出骨髓于另一15%FBS的L-DMEM完全培養(yǎng)液中，反復(fù)吹打，抽吸，形成單細(xì)胞懸液，以1 000 r/min離心5 min；去上清，15%FBS L-DMEM完全培養(yǎng)液重懸沉淀，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中。37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2 d后首次換液，以后每隔2～3 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底約90%，進(jìn)行1∶2傳代。取第3代(P3)純化的BMSCs作為實驗細(xì)胞，用胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度約為1×109L-1待用。

1.4分組及模型制備 將60只小鼠分為健康組、模型組、磷酸緩沖液(PBS)組、BMSCs組，每組15只。除健康組外，其余組采用鼻腔接種法制作毛細(xì)支氣管炎小鼠模型[2-3]。造模成功后，PBS組和BMSCs組分別通過尾靜脈注射法輸注0.5 mL PBS和BMSCs細(xì)胞懸液。

1.5外周血和肺泡灌洗液(BALF)收集 輸注24 h后，小鼠經(jīng)眼球摘除放血后處死，血液放入2 mL抗凝管，-20 ℃?zhèn)溆?；切開氣管后置入留置針，并以縫線固定，0.8 mL PBS灌洗，反復(fù)2次，回收率80%以上，4 ℃、1 500 r/min離心10 min，回收上清置于-80 ℃進(jìn)行細(xì)胞因子檢測[4]。

1.6流式細(xì)胞儀檢測單個核細(xì)胞表型 使用等體積生理鹽水稀釋抗凝血，加入塑料離心管中細(xì)胞分離液表面，以450 g離心25 min收集單個核細(xì)胞，參照李營營等[2]方法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測外周血調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)和Th17的表達(dá)情況。

1.7BALF中白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-10、γ干擾素(IFN-γ)、TGF-β和IL-17細(xì)胞因子檢測 操作步驟均按照ELISA試劑盒所附說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞免疫表型檢測情況 模型組外周血Treg百分率顯著低于健康組(P<0.01),Th17細(xì)胞百分率顯著高于健康組(P<0.01)；BMSCs組外周血Treg百分率顯著高于模型組(P<0.01),Th17細(xì)胞百分率顯著低于模型組(P<0.01)。見表1。

表1 各組外周血Treg百分率和Th17細(xì)胞百分率比較

注：①與模型組比較，P<0.01。

2.2各組IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β水平比較 模型組IL-4、IL-17水平高于健康組(P均<0.05),IFN-γ、IL-10、TGF-β水平低于健康組(P均<0.05)；BMSCs組IL-4、IL-17明顯低于模型組(P均<0.05)，IL-10、TGF-β水平明顯高于模型組(P均<0.05)。見表2。

3 討 論

表2 各組IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ及TGF-β水平比較

注：①與健康組比較，P<0.05;②與模型組比較，P<0.05。

BMSCs是近年來醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中最引人注目的干細(xì)胞之一，但其在骨髓中的含量極少，平均每1萬個有核細(xì)胞中僅有1個，所以根據(jù)BMSCs具有貼壁生長的特性，目前普遍采用貼壁培養(yǎng)法和percoll分離法進(jìn)行分離純化，獲得純度較高的穩(wěn)定的BMSCs。本研究正是在這種方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良培養(yǎng)，對小鼠BMSCs培養(yǎng)血清選擇Gibco頂級胎牛血清，控制血清培養(yǎng)液比例10%～15%，原代培養(yǎng)時使細(xì)胞相對密度較大，48 h首次換液，之后每隔2～3 d換液1次，這樣就能保證原代培養(yǎng)的細(xì)胞長滿瓶底約90%，傳代培養(yǎng)以1∶2比例進(jìn)行，這樣培養(yǎng)到P3代的細(xì)胞純度較高，分化比例低，為小鼠干細(xì)胞體內(nèi)移植提供細(xì)胞材料。

目前有研究表明，BMSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以通過下調(diào)固有免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞的活性來抑制機體的免疫反應(yīng)[5]。崔蕾等[6]將人BMSCs移植治療大鼠急性肺損傷，結(jié)果治療組較對照組血漿促炎因子、腫瘤壞死因子α、IL-6等明顯降低，IL-10明顯升高，表明BMSCs對急性肺損傷有一定保護作用，使肺內(nèi)炎性遞質(zhì)和抗炎遞質(zhì)保持平衡，從而阻止炎癥繼續(xù)進(jìn)展。李營營等[2]通過人臍帶對毛細(xì)支氣管炎大鼠模型免疫調(diào)節(jié)作用研究顯示，RSV毛細(xì)支氣管炎大鼠體內(nèi)存在Th1/Th2失衡及Treg/Th17失衡。因此可以利用干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)這一特性，對肺損傷相關(guān)疾病進(jìn)行病理機制和免疫調(diào)節(jié)研究。

BALB/c小鼠為近交繁殖產(chǎn)生，對多種病原體具有易感性，選擇利用小鼠建立RSV模型的優(yōu)點是它易獲得，遺傳背景清楚均一，基因改造技術(shù)成熟，是目前應(yīng)用最廣泛的實驗動物。小鼠感染RSV后肺部的炎癥變化與人類一致，為典型的間質(zhì)性肺炎的表現(xiàn)。本研究參考近年來的相關(guān)文獻(xiàn)研究，采用鼻腔接種法建立RSV小鼠模型，可以用于RSV感染的發(fā)病機制及治療的研究。

以表達(dá)IL-2和IFN-γ為主的Th1型細(xì)胞和以表達(dá)IL-4、IL-6、IL-10為主的Th2型細(xì)胞，使機體存在Th1/Th2平衡狀態(tài)[7]，機體Th1/Th2一旦失衡則可以引起多種疾病，如哮喘的發(fā)病機制即與其密切相關(guān)[8]，與哮喘有著相似臨床癥狀的毛細(xì)支氣管炎也與Th1/Th2失衡關(guān)系密切[8-9]。本研究顯示，毛細(xì)支氣管炎發(fā)病時，IFN-γ低于健康組，IL-4高于健康組，經(jīng)BMSCs治療后，IL-4水平下降，提示存在Th1/Th2失衡，但具體機制有待進(jìn)一步研究。

免疫調(diào)節(jié)中另一重要的機制即為Treg/Th17平衡[10-12]，本研究結(jié)果顯示，與健康組相比，模型組Treg水平降低，Th17水平升高，同時Treg分泌的IL-10和TGF-β細(xì)胞因子表達(dá)降低，經(jīng)BMSCs治療后，Treg上升，Th17下降。推測Treg可能參與了RSV毛細(xì)支氣管炎病理生理的發(fā)生發(fā)展過程，引起Th2應(yīng)答增強，導(dǎo)致炎癥增加，促進(jìn)Th17分泌IL-17，引起炎癥反應(yīng)。提示毛細(xì)支氣管炎存在與哮喘類似的氣道炎癥。

綜上所述，BMSCs移植入毛細(xì)支氣管炎小鼠體內(nèi)，對一系列的細(xì)胞和細(xì)胞因子都具有積極的調(diào)節(jié)作用，通過降低IL-4,升高IFN-γ，降低Th17細(xì)胞，升高Treg來糾正Th1/Th2和Treg/Th17失衡，達(dá)到治療毛細(xì)支氣管炎的作用，但具體機制和治療方案有待進(jìn)一步研究。

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Immunomodulation of mice bone marrow mesenchymal stem cells In mice with respiratory syncytial virus bronchiolitis

LIU Jinfeng

(Fengning County Hospital, Fengning 068350, Hebei, China)

Objective It is to study the immunomodulation of mice bone marrow mesenchymal stem cells in mice with respiratory syncytial virus bronchiolitis, so to provide new ideas and basis for the treatment of bronchiolitis. Methods Respiratory syncytial virus (RSV) was dripped through nose into mice, to establish an murine model. Obtaining BMSCs cells through the method of adherent culture. Sixty three-week old BALB/C mice were randomly divided into four groups: health control group, model group, PBS group, BMSCs group.PBS group and BMSCs group were injected with PBS and BMSCs by tail vein injection, then experimenting after 24h. Treg and Th17 cellular percentage were detected by FCM, BALF was collected and the levels of cytokines such as IL-4, IFN-γ, IL-10, IL-10, TGF-βand IL-17 were determined by ELISA. Results The percentage of Treg was significantly lower and the percentage of Th17 was higher in model group than that in health group(P<0.05); Compared with the model group, the percentage of Treg was higher and the percentage of Th17 was lower in BMSCs group(P<0.05). Compared with the health group, the level of IL-4 was higher, the level of IFN-γ was lower in model group(P<0.05). On the contrary, compared with the model group, the level of IL-4 was lower(P<0.05) and the level of IFN-γ was higher(P>0.05). The level of IL-10 and TGF-β were lower and the level of IL-17 was higher in model group than that in health group(P<0.05). The level of IL-10 and TGF-β were higher and the level of IL-17 was lower in BMSCs group than model group(P<0.05). Conclusion The immunomodulation of BMSCs in mice with respiratory syncytial virus bronchiolitis was activity, which can correct the Th1/Th2 and Treg/Th17 imbalances, thus to treat for cellular percentage.

bone marrow mesenchymal stem cells; bronchiolitis; cytokine; immunomodulation

劉金鳳，女，副主任醫(yī)師，主要從事兒科臨床及教學(xué)工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.08.005

R-332

A

1008-8849(2015)08-0811-03

2014-09-15