王玉林，王 輝，巴 穎

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.普外科；2.超聲科；3.內(nèi)分泌科，大連116011）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見惡性腫瘤之一［1］，占全身腫瘤疾病的1%。近年來，隨著生活方式的改變、飲食習(xí)慣變化，甲狀腺癌的發(fā)病率逐年上升，吸引人們的關(guān)注和重視［2］。陳竟文等［3］回顧分析復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的病例資料發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌的發(fā)病率近年有明顯升高的趨勢(shì)。因此，努力開發(fā)抑制甲狀腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用的新藥，并進(jìn)一步探討其內(nèi)在的作用機(jī)制是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重要任務(wù)。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)cAMP可抑制或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化［4］，其對(duì)甲狀腺癌的影響及機(jī)制尚不明確［5］。本研究利用cAMP類 似 物，雙 丁 酰 環(huán) 腺 苷 酸（dibutyryl cyclic adenosine monophosphate，dbcAMP），觀察cAMP對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞株FTC－133增殖能力的影響，探討其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 DMSO，dbcAMP，胰島素（Sigma），β－actin抗體（Sigma），Raf1抗體（Cell signaling technology），二抗（HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（北京鼎國(guó)生物試劑公司），預(yù)染蛋白marker（北京鼎國(guó)生物試劑公司），DMEM－F12培養(yǎng)液，胎牛血清（GIBICO公司）、100U/mL青霉素（GIBICO 公司）和100 mg/L鏈霉素（GIBICO公司），谷氨酰胺（GIBICO公司），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Sigma），牛促甲狀腺激素（TSH），Thermo CO2培養(yǎng)箱（USA），iMark酶標(biāo)儀（Bio－Rad，USA），流式細(xì)胞儀（BD FACSCom），熒光定量 PCR儀（ABI 7500HT），甲狀腺癌FTC－133細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將FTC－133細(xì)胞接種于含10U/L的TSH、10mg/L的胰島素、15%的胎牛血清、2mmol/L的谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素的 DMEM－F12（1∶1）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH 值調(diào)到7.2～7.4。在37℃、5%CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。FTC－133細(xì)胞在60mm培養(yǎng)皿中呈單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形，極其不規(guī)則，細(xì)胞之間有明顯的粘連，有少量細(xì)胞突起。隨著培養(yǎng)的時(shí)間增加，細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)，有細(xì)胞聚集現(xiàn)象。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)FTC－133細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FTC－133細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，每孔100μL接種到于96孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，處理組分別加入0.5、1.0、2.0mmol/L dbcAMP，對(duì)照組不加任何試劑。給藥24h和48h后使用MTT法檢測(cè)吸光度值（A值），設(shè)定波長(zhǎng)為490nm，每組包括6個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。增殖抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的繪制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FTC－133細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種到24個(gè)25mL培養(yǎng)瓶，每瓶100μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12h 后，將 0.5、1.0、2.0 mmol/L dbcAMP加入上述培養(yǎng)瓶，每個(gè)濃度6瓶，剩余作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時(shí)每組取1瓶，消化計(jì)數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 dbcAMP處理共同培養(yǎng)24h的FTC－133細(xì)胞，加入0.25%胰酶進(jìn)行消化、吹打細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞脫落后，加入含血清培養(yǎng)基，中和胰酶作用，1 000r/min離心5min、棄上清液并收集細(xì)胞沉淀，用PBS清洗，加入75%的乙醇1mL進(jìn)行細(xì)胞固定，4℃過夜。將FTC－133細(xì)胞的濃度調(diào)整為5×105個(gè)/mL，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次后，加入500μL PBS含50μg/mL 溴化 乙錠（EB），100μg/mL RNase A，0.2%Triton X－100，4℃避光孵育30min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。用FACSCom軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5 通過反轉(zhuǎn)錄的定量PCR（RT－qPCR）、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blotting）方法檢測(cè) FTC－133細(xì)胞中 Raf1水平 FTC－133細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，經(jīng)過酶消化后，計(jì)數(shù)6×105個(gè)/mL的濃度分為2組，包括實(shí)驗(yàn)組（加入0.5mmol/L的dbcAMP）和對(duì)照組（不加dbcAMP），培養(yǎng)24h。抽提細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄呈cDNA后，采用sybr green法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過湘桂定量以2－△△Ct值代表基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。抽提細(xì)胞總蛋白，采用蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，用 Raf1抗體（1∶500）、β－actin抗體（1∶2 000）進(jìn)行免疫雜交，最后顯影和定影，經(jīng)Biorad凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像，蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度采用Quantity One軟件進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間均值比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 處理組及時(shí)間對(duì)FTC－133細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響 隨著濃度增加、時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)TC－133細(xì)胞株A值越低，dbcAMP對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，呈時(shí)間－劑量依賴性，見表1、圖1。

表1 處理組及時(shí)間對(duì)FTC－133細(xì)胞吸光度的影響

2.2 FTC－133細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制 由生長(zhǎng)曲線可知，對(duì)照組FTC－133細(xì)胞在試驗(yàn)的第2天即表現(xiàn)出良好增殖趨勢(shì)，第3天時(shí)細(xì)胞數(shù)已顯著多于各濃度dbcAMP組。處理組中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)及濃度的增加，dbcAMP對(duì)FTC－133細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用越明顯。

2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組的FTC－133細(xì)胞的G0/G1期為（60.75±1.52）%，S期細(xì)胞數(shù)量為（30.19±0.98）%，G2/M 期細(xì)胞的數(shù)量為（8.85±0.48）%。處理組中，使用0.5 mmol/L的dbcAMP處理 FTC－133細(xì)胞后，F(xiàn)TC－133細(xì)胞的G0/G1期［（62.25±1.21）%］沒有顯著的變化，但是FTC－133細(xì)胞的S期［（10.25±0.42）%］細(xì)胞數(shù)量明顯減少，G2/M 期［（27.45±0.75）%］細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（P＜0.01），見圖2。

圖1 處理組及時(shí)間對(duì)FTC－133細(xì)胞增殖抑制率的影響

圖2 不同濃度dbcAMP下FTC－133細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.4 dbcAMP對(duì)FTC－133細(xì)胞中Raf1表達(dá)的影響 相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組Raf1mRNA相對(duì)表達(dá)水平為0.413±0.071；其蛋白相對(duì)表達(dá)0.813±0.074，明顯低于對(duì)照組的1.104±0.133，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 dbcAMP顯著抑制Raf1mRNA和蛋白的表達(dá)

3 討 論

cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等廣泛的生物學(xué)功能。cAMP及其衍生物dbcAMP能夠使細(xì)胞的形態(tài)、行為發(fā)生逆轉(zhuǎn)性改變，有效抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)多種體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞有一定的誘導(dǎo)分化作用。因此設(shè)法提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）水平，抑制增殖、誘導(dǎo)分化，成為大多數(shù)研究使用的手段［6－7］。dbcAMP是cAMP衍生物，能有效提高細(xì)胞內(nèi)AMP水平，它是通過化學(xué)方法對(duì)環(huán)磷腺苷的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，在其分子中加入2個(gè)丁酞基制備而成的，因其具有高親脂性，且對(duì)酸堿環(huán)境比較穩(wěn)定，可被口服吸收，穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC），轉(zhuǎn)換為環(huán)磷腺苷。Chrenek等［8］發(fā)現(xiàn)，dbcAMP能顯著抑制兔輸卵管上皮細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)通過MTT試驗(yàn)、曲線生長(zhǎng)試驗(yàn)和細(xì)胞周期檢查，發(fā)現(xiàn)dbcAMP可顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞株FTC－133的增殖能力，并促進(jìn)其凋亡，抑制增殖的能力與時(shí)間、濃度呈正相關(guān)。

ERK/MAPK（extracellular signal－regulated kinase，mitogen－activated protein kinase）是一條高度保守的，由3組蘇氨酸－精氨酸蛋白激酶模塊構(gòu)成的信號(hào)通路，它通過Raf蛋白（A－raf，B－Raf和 Raf1）、MEK1/2蛋白、ERK1/2蛋白先后磷酸化級(jí)聯(lián)，將分子信號(hào)從細(xì)胞膜向細(xì)胞核傳遞并放大，參與調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等在內(nèi)的多種重要細(xì)胞進(jìn)程［9－10］。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑抗凋亡的機(jī)制是通過p38MAPK途徑激活Nrf2的細(xì)胞核移位，進(jìn)而導(dǎo)致GCLC的誘導(dǎo)作用和谷胱甘肽生成的連鎖反應(yīng)［11］。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)cAMP可通過激活Ras抑制 Raf－1的活化，從而負(fù)性調(diào)節(jié)［12］。通過 RTPCR、Western Blotting，檢測(cè)到dbcAMP顯著抑制了Raf1mRNA及蛋白水平的表達(dá)，提示dbcAMP抑制FTC－133細(xì)胞增殖能力的途徑之一是抑制ERK/MAPK通路。也有研究認(rèn)為甲狀腺癌細(xì)胞的增殖抑制與有絲分裂促成因子（MPF）活性降低直接相關(guān)［13］。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)dbcAMP能夠通過Raf1抑制ERK/MRPK通路，干擾甲狀腺癌細(xì)胞株FTC－133的增殖能力、促進(jìn)其凋亡，為今后深入研究dbcAMP的抑癌機(jī)制和開發(fā)腫瘤治療藥物提供理論基礎(chǔ)。

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