岳黎敏，程書珍，鄭海萍，商小涓

（河北工程大學(xué)：1.醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系；2.醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系；3.附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河北邯鄲056029）

食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是一種高侵襲性的惡性腫瘤，5年生存率僅為10.00%～13.00%，高侵襲轉(zhuǎn)移能力是ESCC預(yù)后差的主要原因。細(xì)胞分化/DNA 結(jié)合抑制因子2（inhibitor of differentiation/DNA binding 2，Id2）屬于螺旋－環(huán)－螺旋（HLH）家族中分化抑制因子Id蛋白家族的成員。近年研究表明Id2分子在多種腫瘤高表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移［1－2］?；|(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）作為 MMPs家族的重要成員，在多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用［3－5］。但ESCC中Id2的表達(dá)及其與MMP9表達(dá)的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。本文通過(guò)檢測(cè)ESCC中Id2和MMP9的表達(dá)情況，以期探討Id2在ESCC發(fā)生、浸潤(rùn)進(jìn)展中的作用，以及Id2與MMP9表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2011～2014年河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院就診的食管癌高發(fā)地區(qū)（河北邯鄲市及周圍地區(qū)）ESCC術(shù)后標(biāo)本70例，另隨機(jī)選取30例手術(shù)切除的食管癌切除段的兩端切緣處組織（＞5cm）為對(duì)照，經(jīng)組織學(xué)確認(rèn)為正常食管上皮。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理醫(yī)師確診為ESCC；（2）術(shù)前未接受放射治療或化學(xué)治療；（3）病史及臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理學(xué)診斷不屬于ESCC；（2）術(shù)前曾接受放射治療或化學(xué)治療；（3）臨床病理資料不完整。

1.2 方法 兔抗人Id2單克隆抗體為Bioworld公司產(chǎn)品，鼠抗人MMP9單抗、SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。免疫組織化學(xué)采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶法（streptavidin peroxidase，SP），按試劑盒說(shuō)明書操作，微波抗原修復(fù)，用已知的乳腺癌陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 Id2結(jié)果判定根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合計(jì)分。染色強(qiáng)度：無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞的百分比：在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比的平均數(shù)，陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞：≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%計(jì)4分；染色程度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比得0分為陰性（－），1～4分為低表達(dá)（＋），＞4分為高表達(dá)（＋＋）。MMP9結(jié)果判定，陽(yáng)性細(xì)胞：＜10%為（－），10%～50%為（＋），＞50%為（＋＋）；計(jì)數(shù)均由2位資深病理醫(yī)師采用雙盲法觀察計(jì)算獲得。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用χ2檢驗(yàn)、等級(jí)資料秩和檢驗(yàn)（Mann－Whitney U 法和Kruskal－Wallis H 法）及Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Id2和MMP9在正常食管上皮和ESCC組織中的表達(dá)Id2與MMP9均主要定位表達(dá)于ESCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（圖1、2），在 ESCC 中兩者表達(dá)陽(yáng)性率分別為92.85%（65/70）和84.29%（59/70），均顯著高于在正常食管上皮中陽(yáng)性率16.67%（5/30）和20.00%（6/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

2.2 Id2、MMP9表達(dá)與ESCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Id2和MMP9的表達(dá)均與ESCC的浸潤(rùn)深度、臨床TNM分期顯著相關(guān)，兩種因子的表達(dá)水平均隨浸潤(rùn)加深、TNM分期級(jí)別增高而升高，浸潤(rùn)深度在T3＋T4組（浸及纖維膜）的表達(dá)水平高于T1＋T2組（未浸及纖維膜），臨床Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期的表達(dá)水平高于Ⅰ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Id2和 MMP9的表達(dá)均與分化程度無(wú)相關(guān)（P＞0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中 MMP9的表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）；而Id2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖1 Id2在ESCC和正常食管上皮的表達(dá)（SP染色×400）

圖2 MMP9在ESCC和正常食管上皮的表達(dá)（SP染色×400）

表1 Id2、MMP9表達(dá)與ESCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

表2 Id2與MMP9在ESCC中表達(dá)的相關(guān)性

2.3 Id2與MMP9表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，ESCC中Id2和 MMP9的表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs＝0.272，P＝0.023），見(jiàn)表2。

3 討 論

Id蛋白為堿性DNA結(jié)合區(qū)缺失的HLH蛋白，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，他主要通過(guò)與眾多的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子（約200多個(gè)）形成無(wú)活性的異二聚體，抑制bHLH的功能，從而抑制細(xì)胞的分化，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。已有研究表明Id分子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞分化以及腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等過(guò)程［1，6］。目前在哺乳動(dòng)物已發(fā)現(xiàn)的Id蛋白有4種：Id1、Id2、Id1和Id4。其中Id1在多種腫瘤中的診斷和治療價(jià)值已得到廣泛關(guān)注。近年研究表明Id2與多種腫瘤的發(fā)生也關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示Id2在ESCC中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常食管上皮，與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道一致［6－8］，提示Id2可能是食管鱗癌的發(fā)生中一個(gè)重要的分子生物學(xué)標(biāo)志。

有關(guān)Id2與腫瘤臨床病理特征關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，Id2的功能存在明顯的組織特異性，在不同類型的腫瘤中其功能和意義也不同，如在前列腺癌、卵巢癌中Id2表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)，與其預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［7］；而在乳腺癌，Id2表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，是其預(yù)后的良性指標(biāo)［2，8］。此外，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞株研究中發(fā)現(xiàn)，Id2蛋白可使多種腫瘤細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)，如在乳腺癌細(xì)胞株MCF－7［9］、卵巢癌細(xì)胞株 SKOV3［9］及前列腺癌細(xì)胞株［7］轉(zhuǎn)染結(jié)構(gòu)性表達(dá)的Id2，均可引起癌細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示在體內(nèi)ESCC組織中Id2的表達(dá)隨腫瘤的浸潤(rùn)加深、TNM分期級(jí)別增高而升高，提示Id2過(guò)表達(dá)使ESCC細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)ESCC浸潤(rùn)進(jìn)展，可能是判斷其生物學(xué)行為和預(yù)后的惡性指標(biāo)。但本研究也顯示Id2的表達(dá)水平與ESCC的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移未見(jiàn)顯著相關(guān)性，結(jié)果與Yuen等［6］一致。

MMP9屬于明膠酶類，又稱為明膠酶B。已從基因水平證實(shí)MMP9由癌細(xì)胞產(chǎn)生，MMP9可降解基膜和細(xì)胞外基質(zhì)，促使癌細(xì)胞穿越組織屏障，向腫瘤的周圍或遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移［3］。MMP9在多種腫瘤中表達(dá)升高，本研究證實(shí)MMP9在ESCC中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常食管上皮，并且MMP9表達(dá)水平與ESCC的浸潤(rùn)深度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，說(shuō)明MMP9的過(guò)表達(dá)在ESCC的侵襲和轉(zhuǎn)移中也具有重要作用，與以往的報(bào)道結(jié)果一致［10］。目前關(guān)于Id分子與MMP表達(dá)關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，將Id1轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞株CNCaP，可使活化型MMP2分泌量顯著升高［7］；采用SiRNA技術(shù)在高侵襲性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145中沉默Id1、Id2、Id3基因表達(dá)，均可引起MMP9基因的表達(dá)下降，其作用機(jī)制已證實(shí)依賴于Id分子的HLH結(jié)構(gòu)域［11］。另 Wang等［12］證實(shí)Id2的靶基因NF－κB可調(diào)控 MMP9的表達(dá)，在ESCC細(xì)胞株EC9706中轉(zhuǎn)染結(jié)構(gòu)性表達(dá)的NF－κB，可致 MMP9表達(dá)升高。本研究顯示在體內(nèi)ESCC組織中Id2與MMP9均高表達(dá)并呈正相關(guān)關(guān)系，提示Id2可能通過(guò)HLH結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄因子NF－κB等途徑促進(jìn)MMP9的表達(dá)，Id2可直接或間接提高癌細(xì)胞的侵襲能力，兩種因子可能協(xié)同促進(jìn)了ESCC的浸潤(rùn)進(jìn)展。

綜上所述，Id2與MMP9在ESCC的發(fā)生及浸潤(rùn)進(jìn)展中可能起著協(xié)同促進(jìn)作用，聯(lián)合檢測(cè)Id2與MMP9的表達(dá)，有望成為評(píng)估其生物學(xué)行為和預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)。但在體內(nèi)ESCC中，Id2能否促進(jìn)轉(zhuǎn)移及Id2與MMP9協(xié)同作用的分子機(jī)制等問(wèn)題，還有待于通過(guò)預(yù)后隨訪、大宗樣本及基因水平等深入研究。

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