陳 悅，馮 放，裴育瑩，俞舒丹，梁葉鶯，趙丕文

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

論 著

四物湯治療更年期綜合征的作用機(jī)制研究

陳 悅，馮 放，裴育瑩，俞舒丹，梁葉鶯，趙丕文

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

目的 觀察四物湯對更年期模型SD大鼠的作用并探討發(fā)揮作用的可能靶點(diǎn)和機(jī)制。方法 將正常SD雌性大鼠40只按體質(zhì)量均衡和隨機(jī)的原則分為正常組、模型組、四物湯低劑量組、四物湯中劑量組、四物湯高劑量組。除正常組外,其余組均切除兩側(cè)卵巢造模。手術(shù)2周后,正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃,四物湯低劑量組、四物湯中劑量組、四物湯高劑量組分別給予3，6,9 g/(kg·d)四物湯灌胃,均1次/d,持續(xù)6 d。第7天腹主動脈取血并分離血清，分離子宮并稱質(zhì)量，免疫組化法測定子宮組織雌激素受體ERα表達(dá)量；蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)檢測藥物血清對T47D細(xì)胞雌激素受體ERα表達(dá)的影響。結(jié)果 正常組大鼠的子宮系數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，四物湯低劑量組、四物湯中劑量組、四物湯高劑量組的子宮系數(shù)與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨著四物湯方劑濃度的升高，子宮系數(shù)有增大的趨勢；大鼠子宮組織ERα表達(dá)模型組與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，四物湯中劑量組和高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；四物湯低、中劑量組的含藥血清能夠明顯提高T47D細(xì)胞ERα的表達(dá)水平(P均<0.01)。結(jié)論 四物湯對更年期綜合征有很好的治療作用，并可提高靶細(xì)胞ERα的表達(dá)水平。

四物湯；更年期綜合征；子宮系數(shù)；T47D細(xì)胞；ERα

更年期婦女最突出的癥狀是絕經(jīng)，同時伴有一系列的生理和心理變化[1]。當(dāng)今社會生活節(jié)奏急速加劇，競爭也越來越激烈，更年期婦女處在生活變化、事業(yè)發(fā)展和家庭負(fù)擔(dān)等多重壓力下，越來越多的婦女出現(xiàn)更年期綜合征的典型癥狀，而更年期癥狀的輕重直接影響到更年期婦女的身體健康和生活質(zhì)量[2]。所以對更年期綜合征的發(fā)病機(jī)制及其治療的研究顯得尤為重要。 現(xiàn)在性激素治療被認(rèn)為是臨床最有效的方法，但是其不良影響有待進(jìn)一步研究[3]。而且此病病程長，病變涉及臟器廣，患者的個體差異大，臨床癥狀多樣化，單純采用性激素難免以偏概全，加之激素應(yīng)用的局限性和不良反應(yīng)，性激素治療的推廣和使用受到限制[4]。近年來，中醫(yī)發(fā)揮其整體觀念、辨證論治的特點(diǎn)，在更年期綜合征的辨證分型、治療用藥等方面取得了一定的進(jìn)展，對更年期綜合征的臨床研究有一定的指導(dǎo)意義[5]。 四物湯作為中醫(yī)藥學(xué)的經(jīng)典方劑，用于治療更年期綜合征取得了很好的效果[6]，但其發(fā)揮藥理作用的途徑和機(jī)制尚待揭示。本研究觀察了四物湯對更年期模型SD大鼠的作用，并利用雌激素受體陽性T47D細(xì)胞探討其發(fā)揮作用的可能靶點(diǎn)和機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料

1.1.1動物 SD大鼠40只，雌性，出生后28 d，體質(zhì)量120 g，購自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK(京)2011-0004。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)在三級動物室，溫度(25±1)℃。

1.1.2實(shí)驗(yàn)用藥物 熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎均購自北京同仁堂中藥店。藥材經(jīng)浸泡、煎煮、濃縮等處理使藥物終質(zhì)量濃度含生藥量2 g/mL，所得藥液置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3實(shí)驗(yàn)用試劑 改良型1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，SDS-聚丙烯酞胺凝膠(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，甲醇(北京化工廠)，PVDF膜(Millipore Immobilon)，脫脂奶粉、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光劑、PBS-T緩沖液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，雌激素受體(ER)α抗體(Santa Cruz公司)，小鼠抗β-Actin單抗、山羊抗小鼠IgG/辣根酶標(biāo)記、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記、免疫組化試劑盒(中杉金橋產(chǎn)品)，X光感膠片(柯達(dá))，DAB顯色試劑盒、細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.4細(xì)胞株 人乳腺癌T47D細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。

1.1.5儀器 電子讀數(shù)分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，普通手術(shù)器械，培養(yǎng)箱(SANYO,MCO218A IC)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Tecan)，顯微鏡(Olympus)，高速離心機(jī)(博勱行儀器有限公司)，電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2分組及造模、給藥 將動物按體質(zhì)量均衡和隨機(jī)的原則分為正常組、模型組、四物湯低劑量組、四物湯中劑量組、四物湯高劑量組。40只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，于第8天戊巴比妥鈉麻醉，模型組和四物湯各組摘除兩側(cè)卵巢造模：在大鼠背部皮層剪開一個約1 cm長的開口，小心分離皮層和肌肉層，找到卵巢位置，在脊柱兩側(cè)肌肉層各剪開一約0.5 cm的開口，找到兩側(cè)卵巢并分離，在靠近卵巢處和距離卵巢約0.1 cm的輸卵管處分別結(jié)扎，然后用剪刀在兩個結(jié)扎處中間剪斷并將卵巢取出，之后用50 ℃的生理鹽水將開口沖洗干凈并分別縫合肌肉層和皮層，最后用碘伏消毒傷口。手術(shù)2周后，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃,四物湯低劑量組、四物湯中劑量組、四物湯高劑量組分別給予3，6,9 g/(kg·d)四物湯灌胃,均1次/d,持續(xù)6 d。

1.3取材 各組動物于最后給藥后第2天稱質(zhì)量，烏拉坦麻醉，腹主動脈取血，4 ℃存放過夜，3 000 r/min離心10 min，小心分離血清，-20 ℃貯存?zhèn)溆?；同時分離、剪下子宮，稱質(zhì)量后立即浸入10%福爾馬林溶液中固定備用。

1.4子宮組織ERα和ERβ免疫組化法染色觀察 子宮組織稱質(zhì)量后，立即放入4%多聚甲醛中，固定過夜，按常規(guī)方法對已固定的組織進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋，5 μm切片，應(yīng)用SP試劑盒進(jìn)行免疫組化法染色，封片，鏡下觀察，測定灰度值，分析ERα的表達(dá)量。

1.5細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞T47D常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2，相對飽和濕度。

1.6蛋白質(zhì)免疫印記(Western blot)檢測 ①蛋白提取及濃度測定:T47D細(xì)胞傳代3次，選取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，加入含10%胎牛血清改良型1640培養(yǎng)基，接種于6孔板內(nèi)，每組6孔，每孔培養(yǎng)液總體積為1 mL培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，換為含10%含藥血清的改良型1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。將各組在含10%含藥血清的改良型1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)的T47D細(xì)胞放置于冰上，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入適量細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞裂解后，4℃，12 000 r/min離心，吸取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA試劑盒測定各組蛋白的濃度。②SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE):取30 g蛋白與等體積4倍上樣Buffer混勻后，100 ℃變性10 min。蛋白樣品進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE分離，5%濃縮膠、12%分離膠。80 V電泳20 min，待條帶遷移至分離膠上緣時調(diào)整為120 V電泳80 min。③轉(zhuǎn)膜:PVDF膜先用甲醇浸泡30 s，再用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡30 min，采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，100 V，75 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)對SDS-聚丙烯酞胺凝膠染色，觀察條帶。④封閉:室溫下在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中于脫色搖床上輕輕搖動封閉1.5 h。⑤一抗孵育:室溫下抗雌激素α一抗(1∶500倍稀釋)10 mL在平皿中于脫色搖床上輕輕搖動孵育2 h,然后用TBST(含200/a Tween20)緩沖液搖床搖動洗膜3次，每次10 min。⑥二抗孵育:二抗1∶1 000稀釋，同上述方法室溫孵育1 h，洗膜。⑦顯色:加ECL發(fā)光劑作用2 min，在暗盒中于X射線片上曝光1 min，顯影、定影，在底片上有蛋白處顯示黑色曝光斑，膠片洗滌干燥。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠子宮系數(shù)比較 模型組子宮系數(shù)明顯低于正常組(P<0.01)，四物湯低劑量組、四物湯中劑量組、四物湯高劑量組的子宮系數(shù)均高于模型組，且隨著四物湯方劑濃度的升高，子宮系數(shù)有增大的趨勢。四物湯中劑量組子宮質(zhì)量高于模型組(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠子宮系數(shù)比較

注:①與正常組比較,P<0.01；②與正常組比較，P<0.05；③與模型組比較,P<0.01。

2.2各組大鼠子宮組織ERα表達(dá)情況 正常組、模型組、四物湯低劑量組、四物湯中劑量組、四物湯高劑量組子宮組織ERα表達(dá)量分別為(100.0±12.0)%,(69.4±17.8)%,(75.6±6.5)%,(93.1±18.6)%,(91.3±14.3)%。模型組子宮組織ERα表達(dá)量明顯低于正常組(P<0.01)，四物湯中劑量組和四物湯高劑量組子宮組織ERα表達(dá)量明顯高于模型組(P均<0.05)。

2.3各組T47D細(xì)胞ERα表達(dá)情況 正常組、模型組、四物湯低劑量組、四物湯中劑量組(四物湯高劑量組藥物血清培養(yǎng)的T47D細(xì)胞因從中所提取的蛋白濃度過低，無法進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印記檢測，故不參與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論)T47D細(xì)胞ERα表達(dá)量分別為(0.536±0.099)%,(0.393±0.067)%,(1.183±0.165)%,(0.855±0.084)%。四物湯低、中劑量組T47D細(xì)胞ERα的表達(dá)水平明顯高于模型組和正常組(P均<0.01)。蛋白質(zhì)免疫印記檢測結(jié)果見圖1。

1為正常組；2為模型組；3為四物湯低劑量組；4為四物湯中劑量組。

3 討 論

目前研究更年期綜合征最常用的動物模型制造方法之一是卵巢摘除法，此方法不僅可顯示更年期激素水平和神經(jīng)遞質(zhì)的變化，還可作為反映伴隨更年期的其他癥狀的模型，可以突出所研究藥物的特點(diǎn)，而且此法造模時間短，成功率高，重復(fù)性好，模型穩(wěn)定[7]。所以本實(shí)驗(yàn)采用了這一常用的動物模型制造方法。結(jié)果表明，模型組大鼠子宮質(zhì)量、子宮系數(shù)、子宮組織ERα表達(dá)率、T47D細(xì)胞ERα表達(dá)率均低于正常組。

四物湯是治療血虛證首選的名方，由熟地、川芎、當(dāng)歸、白芍組成，熟地為君滋陰養(yǎng)血，填精補(bǔ)髓；輔以當(dāng)歸，補(bǔ)血養(yǎng)肝，活血調(diào)經(jīng)；佐以白芍，和營養(yǎng)肝；使以川芎，活血行滯?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明，四物湯具有補(bǔ)血、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、調(diào)節(jié)子宮活動、抗藥物毒性等作用，并且四物湯的藥理作用與其各組分的用量有關(guān)[8]。郝慶秀等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四物湯未表現(xiàn)出促進(jìn)幼鼠子宮質(zhì)量增加的作用。而在本實(shí)驗(yàn)條件下，四物湯對更年期大鼠有促進(jìn)子宮質(zhì)量增加的作用，且與劑量大小有關(guān)系。之所以存在差異可能與動物模型、四物湯中藥的配伍、四物湯灌胃劑量等有關(guān)。

子宮組織中ER的水平直接影響著體內(nèi)性激素對靶器官的作用，ERα分布廣泛，在子宮腔上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞均有表達(dá)[10]。雌激素與相應(yīng)的ER亞型α和/或β結(jié)合后通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，即與靶基因啟動子序列內(nèi)的雌激素應(yīng)答元件(ERE)結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[11]。植物雌激素因結(jié)構(gòu)與雌激素相近，故也可通過與靶細(xì)胞雌激素受體亞型的相互作用而發(fā)揮雌激素或抗雌激素作用。本研究結(jié)果顯示，四物湯可上調(diào)更年期模型大鼠子宮組織ERα表達(dá)，表現(xiàn)出植物雌激素樣作用，這與郝慶秀等[12]研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)是研究和分析蛋白質(zhì)的重要手段[13]，該技術(shù)能彌補(bǔ)免疫組化非精確定量的弱點(diǎn)[14]，更加準(zhǔn)確直觀地反映細(xì)胞中ERα的表達(dá)量。本研究顯示四物湯低、中劑量組的含藥血清能夠明顯提高雌激素依賴腫瘤細(xì)胞T47D細(xì)胞ERα的表達(dá)水平，其結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致，證明四物湯可能是通過上調(diào)靶器官ERα表達(dá)而發(fā)揮治療更年期綜合征的作用。近幾年的研究表明金雀黃素、芹菜素、異補(bǔ)骨脂素和蛻皮甾酮均可促進(jìn)T47D細(xì)胞增殖，而且主要經(jīng)ERα介導(dǎo)[15-16]，與本實(shí)驗(yàn)中四物湯的作用結(jié)果一致。同時，趙丕文等[16]和沈麗霞等[17]研究發(fā)現(xiàn)，異補(bǔ)骨脂素、懈皮素等中藥活性成分均可通過ER途徑或ER亞型調(diào)節(jié)功能發(fā)揮對乳腺癌細(xì)胞增殖的干預(yù)作用。但是由于本研究選取了ERα，ERβ即雙陽性且兩者表達(dá)程度較為相近的T47D細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，所以尚不能排除四物湯對更年期綜合征的治療亦通過上調(diào)靶器官ERβ的表達(dá)或通過調(diào)節(jié)兩種ER亞型的表達(dá)比例起作用，所以對于四物湯治療更年期綜合征的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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Study on the mechanism of Siwutang decoction in the treatment of climateric syndrome

CHEN Yue, FENG Fang, PEI Yuying, YU Shudan, LIANG Yeying, ZHAO Piwen

(Basic Medical College of Beijing University of TCM, Beijing 100029, China)

Objective It is to observe the effect of Siwutang decoction on climateric syndrome in SD rat models and to explore the possible target point and mechanism. Methods Forty female SD rats were randomly divided into five groups: normal group, model group and low, medium and high concentration groups. The rats in all the groups except normal group were resected on both sides of the ovary to establish models. In 2 weeks after operation, normal group and model group was given the same volume of distilled water by intragastric administration, and low, medium and high concentration groups were treated with Siwutang decoction at the dosage of 3, 6, 9 g/(kg·d) respectively once per day and for 6 days. On the seventh day, animals were sacrificed and uteri were separated solely and weighed. The blood was collected, and serum was separated. The expressions of subtypes-estrogen receptor-alpha (ERɑ) on the uteri were detected by immunohistochemical method. The effect of the pharmacological serum on proliferation assay with human breast cancer cell line (T47D) was detected by immune protein imprinting technology. Results There were significant differences in the uterus coefficient between normal group and model group(P<0.01) .The uterus coefficient of three Siwutang groups were different compared with model group, and with the increase of concentration of Siwutang decoction prescription, uterus coefficient increased accordingly. In the expressions of ERɑ on the uteri, there were significant differences between normal group and model group(P<0.01 ) and there were also differences among model group and medium concentration group and high concentration group. Low concentration of Siwutang decoction could increase the expressions of ERɑ in the T47D cells(P<0.01). Conclusion Siwutang has a good effect on menopausal syndrome, and can improve the expression of ERα of target cells.

Siwutang；menopausal syndrome；uterus coefficient；T47D cells； ERα

陳悅，女，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合臨床。

趙丕文，E-mail:pwzhao@sina.com

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目(201310026029)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.08.001

R588

A

1008-8849(2015)08-0799-04

2014-09-30