王 亨 ，余光濤，顧銘杰，于 惠，張 軍，王 艷，王培莉，林 宇，孟 霞，李建基

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州225009 ；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009）

奶牛乳房炎是影響奶牛生產性能的重要疾病，可導致產奶量急劇下降，嚴重者可引起敗血癥，甚至死亡，造成巨大的經濟損失。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌是導致乳腺炎的最常見的3 種細菌[1]。其中，金黃色葡萄球菌雖然不是典型的胞內寄生菌，但是該病原可以通過內在化進入宿主細胞，形成生物膜，在上皮細胞、巨噬細胞中生存，躲避抗生素的治療，難以控制和清除，形成亞臨床或慢性感染[2]。建立金黃色葡萄球菌感染大鼠乳腺的動物模型，對于研究感染和逃避機制，機體抵抗感染的先天性免疫機制，以及為治療藥物的開發(fā)都具有重要意義。鑒于此，該試驗進行了金黃色葡萄球菌感染大鼠乳腺模型的研究。

1 材料

1.1 主要試劑與儀器 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基，購自中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司；戊巴比妥鈉，購自Sigma 公司；高速冷凍離心機（Eppendorf 公司，德國）；動物血球分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；光學顯微鏡（Nikon，日本）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱和培養(yǎng)搖床（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；自制大鼠通乳針。

1.2 試驗動物及分組 體重為275±25 g 同齡妊娠Wistar 大鼠84 只（由揚州大學比較醫(yī)學中心提供），隨機分為試驗組和對照組（n=42）。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌，分離自臨床乳房炎病例，由揚州大學獸醫(yī)外科教研室保存。

2 方法

2.1 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)與計數(shù) 將保存的細菌接種營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單菌落接種營養(yǎng)肉湯，37 ℃，160 r/min，培養(yǎng)24 h。離心菌液，并用無菌生理鹽水洗滌2 次后，制成細菌懸液，采用平板計數(shù)法計數(shù)，菌液放置于4 ℃冰箱備用。使用時，調整菌液濃度為2×107CFU/mL。

2.2 接種方法 于產后4 d 接種細菌。試驗組用通乳針經乳頭管將濃度為2×107CFU/mL 菌液接種第4 對乳腺(雙側)，每側0.1 mL。灌注后輕柔按摩。對照組注射等量的無菌生理鹽水，其他操作同試驗組。

2.3 樣品采集及處理 分別在0 h（灌注前）和灌注后6、12、24、48、72 h 和96 h，取試驗組和對照組大鼠各6 只，觀察臨床癥狀，感觸乳房溫度。麻醉后分離鼠膝部第四對乳腺，觀察乳腺組織的形態(tài)，無菌取乳腺組織用于乳腺中的細菌計數(shù)；另取一份置于中性福爾馬林中固定，做組織學檢查。采集抗凝血用于血常規(guī)檢測。稱量脾和胸腺的重量，檢測臟器指數(shù)。

2.4 乳腺組織中金黃色葡萄球菌的計數(shù) 將乳腺組織放入無菌的勻漿器中，加入生理鹽水（1 mL：100 mg），研磨后轉移至15 mL 離心管中，10 000 r/min（4 ℃）離心5 min，棄上清，加入等體積的生理鹽水重懸，重復以上操作，然后采用平板計數(shù)法計數(shù)。

2.5 數(shù)據(jù)處理 應用SPSS19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，統(tǒng)計結果以平均值±標準誤表示。以“*”表示差異顯著，P＜0.05，以“**”表示差異極顯著，P＜0.01。

3 結果

3.1 臨床癥狀及組織學檢查結果 試驗組大鼠注菌后精神沉郁，飲食欲較注菌前減退，乳房局部增溫。注菌12 h 后，剖檢眼觀即可見乳腺腫脹、充血（見中插彩版圖1，A）。組織學變化：注菌前乳腺腺泡結構完整，小葉間結締組織排列整齊（見中插彩版圖1，B）；注菌后6 h，腺泡內粒細胞增多，基質中炎性細胞浸潤（見中插彩版圖1，C）；注菌后12 h，腺泡內大量粒細胞浸潤，并伴有漿液性滲出，腺泡內現(xiàn)脫落壞死的上皮細胞。毛細血管擴張，基質內粒細胞浸潤（見中插彩版圖1，D）；注菌后24 h，炎性細胞繼續(xù)增多，廣泛分布于腺泡和小葉間結締組織，腺泡上皮細胞脫落、壞死（見中插彩版圖1，E）；注菌后48 h，腺泡結構進一步受到破壞，結構不清（見中插彩版圖1，F(xiàn)）；注菌后72 h，乳腺腺泡受到嚴重破壞，填充大量壞死組織（見中插彩版圖1，G）；注菌后96 h，乳腺腺泡萎縮，炎性細胞減少，結締組織增生（見中插彩版圖1，H）。對照組乳腺剖檢和組織學無明顯變化。

3.2 乳腺組織中感染細菌量的檢查結果 大鼠乳腺注菌6 h，乳腺組織內金黃色葡萄球菌顯著升高，后開始下降，12、24、48、72 h 和96 h 時間點較注菌6h 細菌數(shù)目均極顯著減少（P＜0.01）（見表1）。對照組注射生理鹽水前后，乳腺組織內均未分離到細菌。

3.3 胸腺和脾臟臟器指數(shù)檢查結果 試驗組，胸腺指數(shù)在注菌后6、12、24、72 h 和96 h 較0 h 極顯著升高（P＜0.01），48h 較0 h 顯著升高（P＜0.05）；脾臟指數(shù)在6、24 h 和72 h 較0 h 極顯著升高（P＜0.01），在12 h 和96 h 脾臟指數(shù) 較0 h 顯著升 高（P＜0.05）。對照組，胸腺和脾臟指數(shù)均未見顯著變化（P＞0.05）（見圖2，3，4）。

表1 試驗組乳腺組織中金黃色葡萄球菌數(shù)目的變化

圖2 胸腺指數(shù)的變化

圖3 脾臟指數(shù)的變化

3.4 外周血嗜中性粒細胞數(shù)的檢測結果 與0 h相比較，注菌后6 h，嗜中性粒細胞數(shù)迅速升高，在6 h 和12 h 較0 h 極顯著升高（P＜0.01）；對照組注射生理鹽水后各時間點，嗜中性粒細胞數(shù)均無顯著變化（P＞0.05）（見圖4）。

圖4 外周血嗜中性粒細胞總數(shù)的變化

4 討論

乳房炎的動物模型，最早是在1970 年由Chandler[3]建立的小鼠細菌性乳房炎模型。之后眾多學者采用該動物模型進行細菌性乳房炎、疫苗開發(fā)及藥物治療研究[4-6]。小鼠乳腺動物模型雖然成功復制了奶牛乳腺炎，但細菌接種需要借助放大鏡，且需切除部分乳頭，存在感染風險[3]。鐘凱等[7]在小鼠乳房炎模型的基礎上，通過乳頭管灌注內毒素誘發(fā)大鼠的乳腺炎。張書起等[8]通過大腸桿菌接種大鼠乳腺，成功誘導了大腸桿菌性乳腺炎。

由于大鼠的體型較小鼠大，乳導管明顯，采用自制通乳針在眼睛直視的情況下就可以將針頭置入乳腺管，注入菌液。該方法操作簡便，不需要切除部分乳頭，可操作性強。試驗發(fā)現(xiàn)，外周血中的嗜中性粒細胞在注菌后6 h 和12 h 升高，與注菌0 h 差異極顯著，之后差異不顯著。說明注菌后，可快速激發(fā)機體免疫防御體系，參與乳腺局部的免疫反應。同時在組織學的動態(tài)觀察中也發(fā)現(xiàn)，在6 h、12 h 和24 h，乳腺腺泡內PMNs 逐漸增多，之后出現(xiàn)腺泡損傷，結構不清，萎縮等組織學變化。鐘凱等采用內毒素誘發(fā)大鼠乳腺炎試驗中，發(fā)現(xiàn)不同劑量的內毒素均可引起嗜中性粒細胞在乳腺中的浸潤和游出，并隨劑量的升高，腺泡的破壞程度加重[7]。楊明峰等[9]在用金黃色葡萄球菌誘導小鼠乳腺炎中，發(fā)現(xiàn)乳腺上皮腫脹、脫落，大量淋巴細胞浸潤。而本研究中采用大鼠作為動物模型，觀察到接種后，隨著時間的推移，乳腺腺泡和基質中有大量的PMNs浸潤，即嗜中性粒細胞浸潤為主，這與臨床奶牛乳腺炎的發(fā)病相似。

在對乳腺組織細菌載量的檢測中發(fā)現(xiàn)，注菌后6 h，組織中細菌含量急劇升高，之后開始下降，但在96 h 時依然可以分離到金黃色葡萄球菌，高于300 CFU/mg 乳腺組織。說明注菌后，雖然外周血的炎癥反應在12 h 后恢復正常，組織學中炎性細胞減少，但金黃色葡萄球菌依然存在，而且細菌的含量高于有關學者在小鼠乳腺中檢測到細菌量100 CFU/mg 乳腺組織[5]，說明在大鼠乳腺接種金黃色葡萄球菌后，乳腺中細菌載量雖然減少，但可持續(xù)性存在，引發(fā)該疾病的傳播，與臨床金黃色葡萄球菌感染進程相似。

胸腺是中樞免疫系統(tǒng)，脾臟是淋巴細胞居留和增殖以及產生特異性免疫的器官。脾臟腫大是感染后T 淋巴細胞和B淋巴細胞增殖的表現(xiàn)，因此胸腺脾臟指數(shù)間接反映了機體對各種刺激的免疫反應[10]。試驗中發(fā)現(xiàn)，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)在接種后，直至96 h，均出現(xiàn)顯著或極顯著升高。說明接種后，胸腺和脾臟均發(fā)生了不同程度的增殖，增加了淋巴細胞的活化，但也可能與其提高機體抗氧化活性，減輕自由基損傷有關[7、11]。

綜上所述，該研究建立了金黃色葡萄球菌感染大鼠乳腺的動物模型，動態(tài)觀察了不同時間點乳腺病理組織學和細菌載量的變化，證實該模型可建立與奶牛金黃色葡萄球菌乳腺感染類似的病理過程。因此，可利用該模型研究細菌與乳腺相互作用，藥物和疫苗研制等，具有很好的應用價值。

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