陳 祥，吳海洋，王永強(qiáng)，李曉齊，曹 紅，鄭世軍

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100193）

禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）屬于呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬[1]，于1954 年最早從雞體內(nèi)分離得到[2]，20 世紀(jì)80 年代中期我國也出現(xiàn)了此病的報(bào)道[3]。ARV可以引起關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、肉雞發(fā)育遲緩綜合征（RSS）、呼吸障礙綜合征（MAS），以及呼吸系統(tǒng)疾病等[4-5]，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

ARV無囊膜，有雙層衣殼，屬于雙股RNA（dsRNA）病毒[6]。病毒含有10 個(gè)雙股RNA片段，這些片段至少編碼10 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和4 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[7]。

σB蛋白是由S3 片段編碼，包含367 個(gè)氨基酸，是病毒粒子外衣殼的重要組成部分[8]，該蛋白分別在N末端和C末端存在一個(gè)功能上相互獨(dú)立的基序，即N末端的鋅指基序，C末端的核苷酸結(jié)合基序[9]。σB蛋白攜帶有病毒型特異性中和反應(yīng)的表面抗原，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生群特異性中和抗體[10]。本研究成功表達(dá)了σB重組蛋白并制備出針對它的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究ARV的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、病毒、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動物 sp2/0 細(xì)胞、DF-1 細(xì)胞、DH5α、BL21、質(zhì)粒pGEX-6P-1、pET-28a、已純化的His-VP2 和GST-VP2 蛋白由本實(shí)驗(yàn)室保存等均由本實(shí)驗(yàn)室（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院免疫生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）保存；ARVS1133 毒株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)人畜共患病研究室蘇敬良老師惠贈；6～8 周齡雌性BALB/c 小鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所。

1.2 儀器及主要試劑 HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，均購自Sigma公司；胎牛血清，購自HyClone公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自Gibco 公司；PEG4000，購自Merck 公司；HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；限制性內(nèi)切酶，購自NEB公司；LATaq酶和DNA快速鏈接試劑盒，購自TaKaRa 公司；dNTPs，購自CNS公司；96 孔酶標(biāo)儀，購自Tecan 公司；壓力攪拌式濃縮杯，購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 抗σB蛋白單克隆抗體的制備 小鼠免疫程序按文獻(xiàn)[11]所述方法進(jìn)行。細(xì)胞融合，陽性雜交瘤的篩選參照Current Protocol in Immunology 的方法[12]。腹水純化按照正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法[13]進(jìn)行。

1.4 抗σB蛋白單克隆抗體的鑒定

1.4.1 單克隆抗體的Western Blot 檢測 將DF-1細(xì)胞接種于24 孔板，4×105細(xì)胞/孔，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，將ARV接種細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，收取相應(yīng)細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western blot 鑒定，一抗為含有單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

1.4.2 單克隆抗體親和力的測定及亞類鑒定 按照間接ELISA方法測定單克隆抗體的親和力，數(shù)據(jù)的處理分析按照文獻(xiàn)[14]所述方法。用抗體亞類檢測試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行單克隆抗體亞類的鑒定。

1.4.3 單克隆抗體的特異性鑒定 將實(shí)驗(yàn)室保存的禽呼腸孤病毒（ARV），傳染性腔上囊病病毒（IBDV），禽白血病病毒（ALV），雞傳染性貧血癥病毒（CAV），禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（REV）感染細(xì)胞后收取的細(xì)胞裂解物進(jìn)行電泳，用制備的σB單抗為一抗進(jìn)行Western Blot 檢測。

1.4.4 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定單抗 按照1.4.1 所述方法進(jìn)行病毒感染，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對照。培養(yǎng)24 h 后，用4%多聚甲醛固定和0.2%Triton X-100 透化處理，用10%山羊血清封閉后加入制備的單抗作為一抗，以TRITC標(biāo)記的抗鼠IgG抗體為二抗，經(jīng)反應(yīng)、洗滌后，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測。

1.4.5 單克隆抗體抗原識別區(qū)的確定 以σB不同截短的重組蛋白為抗原，以制備的單抗為一抗，通過Western blot 分析兩株單抗可能識別的抗原表位所在區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 抗σB蛋白單克隆抗體的制備及特異性鑒定如圖1 所示，2 株單抗較純且均能特異識別ARV感染細(xì)胞后產(chǎn)生的σB蛋白。

圖1 單抗的純化和特異性鑒定

2.2 單克隆抗體亞類鑒定及親和力測定 3C3 與4H11 雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗亞類分別為IgG2a 和IgG2b。2 株單抗親和力解離常數(shù)（Kd）分別為5.17×10-10、5.04×10-10（圖2），均屬于高親和力抗體（圖2）。

如中插彩版圖3 所示，獲得的單抗能識別ARV天然病毒蛋白σB抗原。

圖2 σB單克隆抗體親和力測定

圖4 單抗抗原表位識別區(qū)分析（一）

2.3 單克隆抗體抗原識別區(qū)的確定 用分子生物學(xué)技術(shù)將σB蛋白截短并在原核細(xì)胞中表達(dá)，用Western Blot 方法檢測2 株單抗對于截短蛋白的識別情況，2 株單抗的抗原識別位點(diǎn)位于101 aa～167 aa之間（圖4）。

根據(jù)上述方法進(jìn)一步表達(dá)σB不同截短蛋白，結(jié)果表明，3C3 株單抗的抗原識別位點(diǎn)能初步預(yù)測在101 aa～120 aa 之間，4H11 株單抗識別位點(diǎn)初步預(yù)測在121 aa～140 aa 之間（圖5）。

3 討論

ARV廣泛存在于自然界，現(xiàn)已從許多鳥類中發(fā)現(xiàn)。包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種組織細(xì)胞可受到ARV感染，引起宿主免疫功能下降，加劇其他病原的致病性。σB蛋白攜帶有群特異性中和抗原決定簇，在ARV的感染和致病機(jī)理上有重要作用。

ARVσB蛋白與番鴨呼腸孤病毒（MDRV）σB蛋白氨基酸序列有62%的相似性[15]，本試驗(yàn)篩選出的2 株單抗均能與天然病毒蛋白σB發(fā)生反應(yīng)，說明獲得的單抗具有良好的生物學(xué)活性。本研究期望在2 株單抗中鑒定出可以同時(shí)與禽和番鴨呼腸孤病毒發(fā)生發(fā)應(yīng)，或能夠區(qū)分ARV和MDRV的單抗，為ARV和MDRV的鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。在2007 年國內(nèi)學(xué)者制備出了針對ARVσC蛋白[16]的單克隆抗體。在ARV單克隆抗體抗原識別區(qū)的確定方面，Chunhong Yin 等[17]將ARVS1133 株σB單抗識別表位確定在21KTPACW26 之間和32WDTVTFH38 之間。雖然國內(nèi)外已經(jīng)制備出了多株針對ARV的單抗，但這些抗體的抗原識別區(qū)還不十分明確。詳細(xì)的抗原表位分析對研制疫苗和診斷工具都很重要。本研究初步確定了3C3 和4H11 株單抗的抗原識別區(qū)，為研究表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。本研究中所獲得的單抗具有高親和力的特點(diǎn)，為深入研究ARV的致病機(jī)理提供了重要生物學(xué)材料。

圖5 單抗抗原表位識別區(qū)分析（二）

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