陳靜思 王 華 羅曉燕 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院皮膚科，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地，重慶 400014)

樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)是已知的抗原遞呈功能最強(qiáng)的細(xì)胞，能活化初始T 細(xì)胞誘發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(Monocyte-derived dendritic cells，MoDC)是單核細(xì)胞在炎癥刺激環(huán)境下分化而來(lái)的非傳統(tǒng)DC，能通過(guò)激活T 細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)抵抗炎癥反應(yīng)，還可誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)及免疫耐受，近年來(lái)在變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫疾病及腫瘤疫苗等研究領(lǐng)域備受關(guān)注。傳統(tǒng)的從外周血中獲得樹(shù)突狀細(xì)胞的方法需血量較大，因而其研究受到血量限制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良的密度梯度離心法能從少量人外周血中穩(wěn)定分離單核細(xì)胞并體外誘導(dǎo)培養(yǎng)為成熟MoDC，使研究MoDC 更為高效、便捷。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Dextran-T500 購(gòu)自美國(guó)Pharmacia 公司;Nycoprep 分離液購(gòu)自挪威Axisshield 公司;牛血清白蛋白BSA(全組分)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細(xì)胞介素4(rhIL-4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)購(gòu)自美國(guó)peprotech 公司;小鼠抗人PE-CD11c、PECy5-CD1a 及同型對(duì)照單抗購(gòu)自美國(guó)BD 公司;小鼠抗人FITC-MHCⅡ、CD80、CD83、CD86、CD14 及同型對(duì)照單抗購(gòu)自北京四正柏公司;臺(tái)盼藍(lán)染液購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;絲裂霉素C 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。8% dextran 液由8g dextran-T500 溶于100 ml 生理鹽水配制而成;Washmono 液由5 g BSA 溶于500 ml 含1.7 ml 0.5 mol/L EDTA 液的生理鹽水配制而成。Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自上海睿鈺生物科技有限公司;倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司;掃描電鏡購(gòu)自日本日立公司;FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 改良密度梯度離心法分離人外周血單核細(xì)胞 取得6 名健康志愿者知情同意后，取EDTA 抗凝外周血10 ml，用改良的密度梯度離心法分離單核細(xì)胞，具體步驟如下:①在10 ml EDTA 抗凝外周血中加入2 ml 8%dextran 液沉降紅細(xì)胞45 min。②取上層血漿緩慢加入裝有Nycoprep 液的離心管中(血漿∶Nycoprep=2 ∶1)，20℃1 750 r/min 離心20 min。③離心后可見(jiàn)中間白膜層細(xì)胞，小心吸出白膜層細(xì)胞放入新離心管中，加入10 ml Wash-mono 液，20℃800 r/min 離心15 min。④離心后可見(jiàn)細(xì)胞沉淀，棄上清，加入10 ml Wash-mono 液重懸混勻，20℃800 r/min 離心10 min 清洗2 遍。⑤取20 μl 細(xì)胞懸液加入20 μl 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色3 min 后用Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并測(cè)活性率;流式檢測(cè)CD14表達(dá)率。

1.2.2 MoDC 的體外誘導(dǎo)培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素、50 ng/ml(500 U/ml)rhGM-CSF 和50 ng/ml(500 U/ml)rhIL-4 的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106ml-1接種于24 孔板中(1 ml/孔)，放入5%CO237℃孵箱培養(yǎng)2 h 后輕輕吸去上清再直接加入新培養(yǎng)基。第2 天半量換液，第4 天收集細(xì)胞，取一半細(xì)胞檢測(cè)表型及刺激淋巴細(xì)胞增殖能力;剩余一半細(xì)胞全量換液并加入10 ng/ml TNF-α 繼續(xù)培養(yǎng)3 d 刺激細(xì)胞成熟。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);取培養(yǎng)7 d MoDC 行掃描電鏡，具體步驟如下:①將預(yù)先用多聚賴氨酸包被的玻片放于24 孔板一孔中，將分離的單核細(xì)胞接種于孔中培養(yǎng)。同前述第2 天半量換液，第4 天加入TNF-α 繼續(xù)培養(yǎng)3 d 刺激細(xì)胞成熟。②培養(yǎng)7 d 后將玻片緩慢取出，并收集培養(yǎng)基1 000 r/min 離心5 min，用PBS 液清洗2遍，留少量PBS 液重懸細(xì)胞后滴加在玻片上，將玻片在室溫靜置1 h，使細(xì)胞自然沉降附著在玻片上。③用生理鹽水輕輕洗滌玻片2 遍;用2.5%戊二醛在4℃固定玻片1 h，PBS 液洗2 遍，每次30 min 以上;再用1%鋨酸固定1 h，PBS 液洗2 遍后經(jīng)30%、50%、70%、80%、90%、100% 乙醇梯度脫水各5 min。④再行酸異戊酯置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空噴鍍，最后在掃描電鏡下觀察并照相。

1.2.3 流式檢測(cè)MoDC 表型 分別取培養(yǎng)4 d MoDC 和7 d MoDC，PBS 液清洗2 遍后加入1.2 ml PBS 液重懸混勻，取流式試管編號(hào)，1 號(hào)加入PE 及PECy5 同型對(duì)照單抗各20 μl，2～6 號(hào)都分別加入PE-CD11c+及PECy5-CD1a+單抗各20 μl 后，2 號(hào)再加入FITC 同型對(duì)照單抗10 μl，3 號(hào)再加入FITCMHCⅡ+單抗10 μl，4 號(hào)再加入FITC-CD80+單抗10 μl，5 號(hào)再加入FITC-CD83 單抗10 μl，6 號(hào)再加入FITC-CD86 單抗10 μl。分別取200 μl 細(xì)胞懸液加入流式試管中渦旋后避光靜置半小時(shí)，PBS 液清洗3 遍后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 CCK-8 檢測(cè)MoDC 刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力

1.2.4.1 分離人外周血淋巴細(xì)胞 重慶市血液中心提供手工采集血小板后剩余人外周血60 ml，用ficoll 密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，具體步驟如下:①加入等體積PBS 液稀釋。②將稀釋血緩慢加入裝有Nycoprep 液的離心管中(稀釋血:Nycoprep=2 ∶1)，20℃2 150 r/min 離心30 min。③小心吸出白膜層細(xì)胞放入新離心管中，加入10 ml PBS 液，20℃1 200 r/min 離心10 min。④離心后可見(jiàn)細(xì)胞沉淀，棄上清，加入10 ml PBS 液重懸混勻，20℃1 000 r/min 離心5 min 清洗2 遍。⑤用含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞接種于75 ml 培養(yǎng)瓶放入5% CO237℃孵箱培養(yǎng)2 h 使單核細(xì)胞貼壁。⑥2 h 后取出細(xì)胞，直接吸出不貼壁的淋巴細(xì)胞放入新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)待用。⑦流式檢測(cè)淋巴細(xì)胞百分比并行瑞氏姬姆薩染色鑒定淋巴細(xì)胞。

1.2.4.2 CCK-8 檢測(cè)增殖指數(shù) ①分別取培養(yǎng)4 d MoDC 和7 d MoDC 調(diào)整細(xì)胞密度為106ml-1，用10 μg/ml 絲裂霉素C 37℃處理4 h 后RPMI1640 培養(yǎng)基清洗2 遍作為刺激細(xì)胞。②取淋巴細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為106ml-1，在圓底96 孔板中每孔加入5×104個(gè)細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，再將經(jīng)絲裂霉素C 處理后的培養(yǎng)4 d MoDC 和7 d MoDC 與淋巴細(xì)胞按1 ∶1、1 ∶10、1 ∶50、1 ∶100 比例(終體積為200 μl)共培養(yǎng)5 d，不同比例做3 個(gè)復(fù)孔，還設(shè)立只有淋巴細(xì)胞的空白對(duì)照孔。③共培養(yǎng)5 d 后每孔加入20 μl CCK-8 液繼續(xù)孵育4 h 后用酶標(biāo)儀檢測(cè)(450 nm)OD 值并計(jì)算增殖指數(shù) (Proliferation index，PI)，PI=共培養(yǎng)孔OD 值-空白對(duì)照孔OD 值/共培養(yǎng)孔OD 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Flowjo 軟件分析流式數(shù)據(jù)，用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均使用±s 表示，采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MoDC 形態(tài) 分離得到單核細(xì)胞(1.09±0.21)×107個(gè)，活性率為97.98%±0.74%。流式檢測(cè)表達(dá)CD14 的細(xì)胞占80%以上(圖1)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞小呈圓形，形態(tài)單一，貼壁生長(zhǎng)(圖2);培養(yǎng)第2 天即可見(jiàn)少量細(xì)胞聚集成團(tuán)，疏松貼壁生長(zhǎng);培養(yǎng)第4 天集落細(xì)胞增多，體積增大，懸浮生長(zhǎng);培養(yǎng)第6 天大多數(shù)細(xì)胞呈集落懸浮生長(zhǎng)，形狀不規(guī)則(圖3)。取培養(yǎng)7 d MoDC 做掃描電鏡觀察:細(xì)胞直徑14 μm 左右，類圓形，可見(jiàn)表面有典型的毛刺生長(zhǎng)(圖4)。

2.2 MoDC 表型 培養(yǎng)4 d 的未成熟MoDC 表達(dá)CD11c 為88.44%±6.02%，CD11c+CD1a+雙陽(yáng)性為39.53%±14.18%;而經(jīng)TNF-α 刺激培養(yǎng)7 d 的成熟MoDC 表 達(dá)CD11c 為93.58%± 4.93%，CD11c+CD1a+雙陽(yáng)性為76.91%±10.95%(圖5)。培養(yǎng)7天成熟CD11c+CD1a+雙陽(yáng)性MoDC 表面MHC Ⅱ、CD80、CD83、CD86 平均熒光強(qiáng)度(Mean fluorescent intensity，MFI)均較培養(yǎng)4 d 未成熟MoDC 升高，MHCⅡMFI 升高約3 倍;CD80、CD83、CD86 MFI 升高約5 倍，具有顯著差異(表1)。無(wú)論是培養(yǎng)7 d成熟MoDC 還是4 d 未成熟MoDC MHC Ⅱ表達(dá)均較協(xié)同刺激分子高，協(xié)同刺激分子中CD86 表達(dá)量最高，CD83 最低。

圖1 1 例健康志愿者單核細(xì)胞流式散點(diǎn)圖(Q3:CD14+)Fig.1 Flow cytometry scatter plot of monocytes from a healthy volunteer(Q3:CD14+)

圖2 倒置相差顯微鏡觀察分離的人外周血單核細(xì)胞(×100)Fig.2 Monocytes from human peripheral blood observed by invert optical microscope (×100)

圖3 倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)第6 天的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(×100)Fig.3 MoDC cultured on 6th day observed by invert optical microscope (×100)

圖4 掃描電鏡下觀察培養(yǎng)第7 天的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(×2 000)Fig.4 MoDC cultured on 7th day observed by scanning electron microscope (×2 000)

圖5 1 例健康志愿者M(jìn)oDC 流式散點(diǎn)圖(Q1+Q2:CD11c+/Q2:CD11c+CD1a+)Fig.5 Flow cytometry scatter plot of MoDC from a healthy volunteer(Q1+Q2:CD11c+/Q2:CD11c+CD1a+)

圖7 瑞氏姬姆薩染色的淋巴細(xì)胞Fig.7 Lymphocytes were observed in Wright Giemsa staining

表1 未成熟MoDC 與成熟MoDC MHCⅡ、CD80、CD83、CD86 平均熒光強(qiáng)度(±s)Tab.1 Mean fluorescent intensity of MHCⅡ，CD80，CD83，CD86 on immature MoDC and mature MoDC(±s)

表1 未成熟MoDC 與成熟MoDC MHCⅡ、CD80、CD83、CD86 平均熒光強(qiáng)度(±s)Tab.1 Mean fluorescent intensity of MHCⅡ，CD80，CD83，CD86 on immature MoDC and mature MoDC(±s)

Note:1)P＜0.05.

2.3 MoDC 刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力 用臨床上流式鑒定淋巴細(xì)胞的條件(CD45陽(yáng)性及SSC值小)圈定淋巴細(xì)胞得到細(xì)胞百分比在80%以上(圖6);用瑞氏姬姆薩染色后鏡下鑒定為淋巴細(xì)胞(圖7)。

刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，僅接種淋巴細(xì)胞的空白對(duì)照孔OD 值在未成熟MoDC 組與成熟MoDC 組間無(wú)差異(0.423 4±0.046 6 vs 0.450 4±0.081 5，P＞0.05)，而未成熟MoDC 刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)在不同比例均較培養(yǎng)7 d 成熟MoDC 低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 未成熟MoDC 與成熟MoDC 刺激淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(±s)Tab.2 Proliferation index of lymphocyte stimulated by immature MoDC and mature MoDC(±s)

表2 未成熟MoDC 與成熟MoDC 刺激淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(±s)Tab.2 Proliferation index of lymphocyte stimulated by immature MoDC and mature MoDC(±s)

Note:1)P＜0.05.

3 討論

樹(shù)突狀細(xì)胞是已知的抗原遞呈功能最強(qiáng)的細(xì)胞，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，在誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答和免疫耐受中發(fā)揮重要作用。半世紀(jì)前，Ralph Steinman 等首次在小鼠脾臟中發(fā)現(xiàn)DC，隨后研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)DC 起源于骨髓CD34+造血干細(xì)胞，其中，CD34+髓系造血干細(xì)胞在骨髓內(nèi)分化為單核細(xì)胞和DC 前體細(xì)胞，兩者進(jìn)入血液后遷移至淋巴器官和外周組織，DC 前體細(xì)胞進(jìn)一步分化為朗格漢斯細(xì)胞和組織間隙DC，由此分化而來(lái)的DC 為髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞(mDC);而CD34+淋巴系造血干細(xì)胞則分化為漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pDC)。人體內(nèi)DC 還常被分為傳統(tǒng)DC 和非傳統(tǒng)DC 兩類，傳統(tǒng)DC是正常生理狀態(tài)下具有典型形態(tài)和功能的DC，包括遷移的DC 和淋巴樣的DC;非傳統(tǒng)DC 通常不存在于正常生理情況下，而在炎癥刺激應(yīng)答情況下顯著增多，包括pDC 和MoDC［1，2］。

正常生理情況下，人體內(nèi)大多數(shù)DC 處于未成熟狀態(tài)，高表達(dá)抗原捕獲相關(guān)的表面受體，例如:甘露糖受體和免疫球蛋白受體，有很強(qiáng)的抗原捕獲能力;低表達(dá)MHCⅡ分子及黏附分子、協(xié)同刺激分子(CD80、CD83、CD86)，從而刺激淋巴細(xì)胞活化能力較低。而在炎癥刺激應(yīng)答情況下，未成熟DC 表達(dá)甘露糖受體和免疫球蛋白受體下降，MHCⅡ、CD40、CD80、CD83、CD86 等表達(dá)顯著升高而成為成熟DC，并向儲(chǔ)存初始T 細(xì)胞的外周淋巴器官遷移，通過(guò)分泌細(xì)胞因子及上調(diào)的分子刺激初始T 細(xì)胞活化增殖并分化為Th1、Th2、Th17 型效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮適應(yīng)性免疫應(yīng)答。不僅如此，成熟DC 還可以直接活化B細(xì)胞和NK 細(xì)胞［1-4］。

MoDC 是單核細(xì)胞在炎癥刺激環(huán)境下分化而來(lái)的非傳統(tǒng)DC，分布于皮膚、肺、腎臟、腸道等外周組織。本實(shí)驗(yàn)從正常人少量外周血分離單核細(xì)胞［5，6］，經(jīng)rhGM-CSF、rhIL-4 聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d 獲得未成熟MoDC 后加入TNF-α，TNF-α 能提高DC 表面GM-CSF 受體的數(shù)量，促進(jìn)CD86 和CD40 表達(dá)，阻斷粒細(xì)胞分化途徑，促進(jìn)DC 分化、成熟。CD11c是mDC 的特應(yīng)性表面標(biāo)記，CD11c+CD1a+則是MoDC 的典型標(biāo)記。培養(yǎng)4 d 未成熟MoDC 中已有約88.44% 表達(dá)CD11c，而只有約39.53% 雙表達(dá)CD11c+CD1a+，且MHCⅡ分子及協(xié)同刺激分子表達(dá)量都較低，說(shuō)明培養(yǎng)4 d 后絕大多數(shù)單核細(xì)胞已經(jīng)分化為mDC，但只有少數(shù)細(xì)胞分化為特異性的MoDC，且處于未成熟狀態(tài);而經(jīng)TNF-α 刺激培養(yǎng)7 d 的MoDC 中 有 高 達(dá)93.58% 表 達(dá) CD11c，約76.91%雙表達(dá)CD11c+CD1a+，較前明顯增多，MHCⅡ分子及協(xié)同刺激分子表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，絕大多數(shù)單核細(xì)胞能分化為特異性MoDC，且TNF-α 能有效誘導(dǎo)MoDC 成熟。成熟MoDC 較其他類型DC 更高表達(dá)CD11c、MHCⅡ分子及協(xié)同刺激分子，MoDC 與同種異體淋巴細(xì)胞按不同比例共培養(yǎng)時(shí)［7］，成熟MoDC 刺激淋巴細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于未成熟MoDC，說(shuō)明其具有更強(qiáng)的抗原遞呈及交叉遞呈能力，能有效激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

MoDC 誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫能有效保護(hù)機(jī)體抵抗外來(lái)細(xì)菌、病毒和真菌等病原體感染。同時(shí)，MoDC 在多種變態(tài)反應(yīng)性疾病例如:特應(yīng)性皮炎、支氣管哮喘、結(jié)膜炎等的發(fā)生發(fā)展中起作用。近年來(lái)，其在抗腫瘤免疫和調(diào)節(jié)自身免疫性疾病免疫應(yīng)答方面更是備受關(guān)注［9-14］。大多數(shù)惡性腫瘤表達(dá)有免疫原性的抗原，但通過(guò)阻斷DC 成熟抑制其功能使機(jī)體不能產(chǎn)生有效地免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，免疫治療成功的關(guān)鍵并不在于患者體內(nèi)現(xiàn)存DC 的活化，而是患者體內(nèi)腫瘤引流淋巴結(jié)中MoDC 的數(shù)量，說(shuō)明MoDC是DC 抗腫瘤免疫的最關(guān)鍵物質(zhì)。通過(guò)向患者體內(nèi)淋巴結(jié)注射體外培養(yǎng)載有腫瘤相關(guān)抗原肽或溶解產(chǎn)物的MoDC 可有效激活患者的抗腫瘤免疫［9-13］。在自身免疫反應(yīng)疾病中，DC 誘導(dǎo)自體反應(yīng)的CD4+和CD8+T 細(xì)胞分化而不是正常情況下產(chǎn)生免疫抑制作用的調(diào)節(jié)T 細(xì)胞或者使自體反應(yīng)的T 細(xì)胞無(wú)效能。目前研究發(fā)現(xiàn)將編碼具有免疫抑制作用細(xì)胞因子(例如:IL-10、IL-4、TNF-α)的基因轉(zhuǎn)染入MoDC或者應(yīng)用協(xié)同刺激分子CD83、CD86和CD80的抗體阻斷協(xié)同刺激分子與自體反應(yīng)的T 細(xì)胞上CD28受體結(jié)合，抑制MoDC 成熟及其刺激T 細(xì)胞分化為效應(yīng)T 細(xì)胞能力降低免疫反應(yīng)可調(diào)節(jié)自身免疫疾病的異常免疫應(yīng)答［14］。

人體內(nèi)DC 數(shù)量少，僅占外周血細(xì)胞的1%以下，體外培養(yǎng)MoDC 這一方法使得研究MoDC 在疾病發(fā)病及治療中的作用成為可能［6-8］。然而，傳統(tǒng)體外培養(yǎng)MoDC 方法耗血量大，使得MoDC 在兒童變態(tài)反應(yīng)性、自身免疫性、腫瘤等疾病的研究中受限。本實(shí)驗(yàn)方法可以解決兒童取血量受限而通過(guò)傳統(tǒng)方法培養(yǎng)MoDC 量少的難題，為兒童變態(tài)反應(yīng)性、自身免疫性、腫瘤等疾病中MoDC 的研究奠定基礎(chǔ)。

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