尚 珂 張俊峰 程相朝 張春杰 李銀聚 陳桂華 顏云飛 翟崇凱 趙戰(zhàn)勤

(河南省動(dòng)物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003)

近年來(lái)，減毒沙門菌活疫苗載體已經(jīng)被應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，尤其是在無(wú)抗性宿主-載體平衡致死系統(tǒng)被成功構(gòu)建以來(lái)，更是受到了學(xué)者們的青睞，因而是當(dāng)前的重點(diǎn)研究對(duì)象之一。減毒沙門菌能夠?qū)?lái)自病毒、細(xì)菌、寄生蟲的保護(hù)性抗原基因有效地遞呈給免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)出針對(duì)該外源基因的特異性黏膜、細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，因此其應(yīng)用前景非常廣闊［1］。在國(guó)內(nèi)外，減毒沙門菌作為活疫苗載體的研究主要應(yīng)用于鼠傷寒沙門菌，而豬霍亂沙門菌作為活疫苗載體的研究相對(duì)較少。

豬霍亂沙門菌屬于革蘭氏陰性胞內(nèi)侵襲性細(xì)菌，是引起人類食物中毒和仔豬副傷寒的主要病原之一。理想的減毒沙門菌活疫苗載體依賴于合適的減毒沙門菌菌株。本室為開發(fā)應(yīng)用于豬的口服活疫苗載體，前期已成功構(gòu)建出減毒豬霍亂沙門菌ΔcrpΔcyaC78-1［2］。其中毒力基因crp 和cya 分別編碼了環(huán)一磷酸腺苷受體蛋白(cAMP receptor protein)和腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase)。crp和cya 同時(shí)缺失之后會(huì)降低對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸以及碳源的利用能力，影響鞭毛、菌毛和外膜蛋白的合成，從而使其毒力顯著降低。國(guó)內(nèi)外研究均表明，該類雙缺失株比crp 和cya 單缺失株毒力更低，且具有良好的免疫原性［3］。

asd 基因?qū)儆跔I(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)志基因，編碼了天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶，是二氨基庚二酸(DAP)合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，而DAP 又是構(gòu)成革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖的基本成分，因此在無(wú)外源DAP補(bǔ)充的條件下asd 基因缺失株將會(huì)裂解死亡［4］。因此，本文在減毒豬霍亂沙門菌ΔcrpΔcyaC78-1 的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步缺失asd 基因，以營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)志代替抗生素的抗性標(biāo)記，并將攜帶完整asd 基因的互補(bǔ)質(zhì)粒pYA3493 電轉(zhuǎn)至該缺失株，構(gòu)建無(wú)抗性宿主-載體平衡致死系統(tǒng)ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)，為開發(fā)應(yīng)用于豬的穩(wěn)定攜帶異源基因的口服活疫苗載體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件 減毒豬霍亂沙門菌ΔcrpΔcyaC78-1、弱毒疫苗株C500、重組自殺性質(zhì)粒pREΔasd 及其宿主菌大腸桿菌χ7213(Thi-1 thr-1 leuB6 fhuA21 lacY1 glnV44 ΔasdA4 recA1 RP4 2-Tc Mu［λpir］Kmr)由本室保存，各培養(yǎng)基根據(jù)需要加入終濃度為25 μg/ml 的氯霉素(Chloramphenicol，Cm)、100 μg/ml 的氨芐青霉素(Amplicillin，Amp)、50 μg/ml 的二氨基庚二酸(DL-α，ε-Diaminopimelic acid，DAP)。

1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 11 種沙門菌屬診斷血清及各種單因子血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司;二氨基庚二酸(DAP)、氯霉素(Cm)購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司;Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、瓊脂糖購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;凝膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程有限公司;麥康凱瓊脂和生化鑒定試劑均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。6～8 周齡KM 雌鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.3 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)NCBI 中GenBank收錄的鼠傷寒沙門菌LT2(No.AE008859)中的asd基因序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物。引物Pi1/Pi2 用于豬霍亂沙門菌的特異性鑒定。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

1.4 豬霍亂沙門菌缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 的構(gòu)建 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［5，6］所述的方法并加以改進(jìn)。首 先 以 χ7213 (pREΔasd)為 供 體 菌，ΔcrpΔcyaC78-1 為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。供體菌接種于含氯霉素(Cm)和二氨基庚二酸(DAP)的LB液體培養(yǎng)基，受體菌接種于LB 液體培養(yǎng)基上，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，然后各取100 μl 菌液，再加入3 ml LB 液體培養(yǎng)基混勻，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，之后取出100 μl菌液涂布于含氯霉素的LB 固體平板上培養(yǎng)15～24 h，挑選Cm 抗性的接合子，用引物pa1/pa2 擴(kuò)增鑒定。陽(yáng)性接合子在含DAP 和10%蔗糖的NB(不含NaCl 的LB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，連續(xù)10 倍稀釋選取合適的稀釋度涂布于含DAP 和10%蔗糖的NB(不含NaCl 的LB)固體平板上，培養(yǎng)15～24 h，挑取光滑透明單菌落同時(shí)劃線于含DAP 和10%蔗糖的NB(不含NaCl 的LB)固體平板和不含DAP 含10%蔗糖的NB 固體平板上，篩選DAP 依賴且蔗糖抗性(SUCr)的菌落，用引物pa1/pa2 擴(kuò)增鑒定，陽(yáng)性菌落進(jìn)一步用pa2/pa3 擴(kuò)增鑒定。

1.5 重組菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的構(gòu)建及鑒定 將-70℃保存的χ6097(pYA3493)劃線接種于LB 固體平板，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種于4 ml 的LB 液體培養(yǎng)基，37℃200 r/min 振蕩培養(yǎng)15 h 后，提取互補(bǔ)質(zhì)粒pYA3493。取5 μl 質(zhì)粒加入100 μl ΔcrpΔcya-ΔasdC78-1 的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)中混合均勻，冰浴30 min，將混合物迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯中，放入基因?qū)雰x進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)參數(shù)如下:電壓2 000 V、電阻200 Ω、電容25 μF、放電時(shí)間不超過(guò)6 ms。電擊后迅速加入400 μl 預(yù)熱的LB 液體培養(yǎng)基，37℃180 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h，最后取出100 μl 涂布于不含DAP 的LB 固體平板上。15～24 h后挑取無(wú)色單菌落分區(qū)接種于LB 固體培養(yǎng)基，待菌落長(zhǎng)出之后用引物pa2/pa3 擴(kuò)增鑒定。

表1 PCR 擴(kuò)增所用的引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amplification

1.6 重組菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的生物學(xué)特性研究

1.6.1 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的表型鑒定將疫苗株C500、ΔcrpΔcyaC78-1、ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(pYA3493)劃線接種于含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和LB 瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 h 后進(jìn)行O 和H 抗原等血清型鑒定，再分別轉(zhuǎn)接于含葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇等碳源生化鑒定培養(yǎng)基進(jìn)行生化反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行VP、MR、H2S 產(chǎn)生試驗(yàn)。

1.6.2 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的遺傳穩(wěn)定性 將ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)劃線接種于LB 固體培養(yǎng)基，挑取單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min 培養(yǎng)16 h，按比例1 ∶100 轉(zhuǎn)接新鮮LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，重復(fù)上述步驟連續(xù)轉(zhuǎn)接60 次，取第10、20、30、40、50、60 代菌液，用引物pa1/pa2 進(jìn)行PCR 鑒定，以研究Δasd 基因的遺傳穩(wěn)定性。

1.6.3 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的生長(zhǎng)特性研究 分別挑取疫苗株C500、ΔcrpΔcyaC78-1、ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的單菌落，接種于LB 液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，取100 μl 菌液連續(xù)稀釋至合適濃度，并作3 個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)數(shù)并計(jì)算原液濃度。轉(zhuǎn)接菌液至新鮮培養(yǎng)基，調(diào)整濃度至1×106CFU/ml，37℃、180 r/min 振搖培養(yǎng)。每隔1 h 取一次樣，按上述方法平板計(jì)數(shù)，繪制三者的生長(zhǎng)曲線。

1.6.4 重組菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(PYA3493)的毒力測(cè)定 為測(cè)定重組菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)對(duì)6～8 周齡的KM 雌鼠的毒力，將60只小鼠隨機(jī)分為3 個(gè)大組，每個(gè)大組包含4 個(gè)小組，將 C500、ΔcrpΔcyaC78-1、ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)分別劃線于LB 固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，再分別挑取單菌落，接種于LB 液體培養(yǎng)基，按設(shè)定的劑量口服攻毒小鼠，濃縮或稀釋菌液，每只攻毒200 μl，另作無(wú)菌PBS 對(duì)照組，連續(xù)觀察28 d，用Bliss 軟件計(jì)算各組的LD50。

2 結(jié)果

2.1 豬霍亂沙門菌缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 的構(gòu)建與鑒定 供體菌與受體菌在LB 液體培養(yǎng)基混合培養(yǎng)的過(guò)程中，發(fā)生第一次同源重組，重組自殺性質(zhì)粒pREΔasd 被整合至ΔcrpΔcyaC78-1 的染色體上，故陽(yáng)性接合子同時(shí)具有asd 基因的兩個(gè)拷貝，即缺失型(315 bp)和完整型(1 803 bp)，其表型為氯霉素抗性蔗糖敏感(CmrSUCs)。因此用該基因的上臂內(nèi)部引物pa1 和下臂內(nèi)部引物pa2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，可同時(shí)擴(kuò)得asd 缺失型(315 bp)和asd 完整型(1 803 bp)兩個(gè)條帶(圖1A)。pREΔasd 含有反向選擇基因sacB 即蔗糖敏感基因，因此陽(yáng)性接合子在含DAP 和10%蔗糖且不含NaCl 的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)會(huì)發(fā)生第二次同源重組。重組之后只有兩種結(jié)果，恢 復(fù) 為 ΔcrpΔcyaC78-1 或 突 變 為ΔcrpΔcyaΔasdC78-1。挑取單菌落用引物pa1/pa2 PCR 擴(kuò)增鑒定，可擴(kuò)得315 bp(ΔcrpΔcyaΔasdC78-1)和1 803 bp(ΔcrpΔcyaC78-1)兩種條帶(圖1B)。為了證明擴(kuò)增所得的缺失片段來(lái)自于染色體而不是自殺性質(zhì)粒，陽(yáng)性菌落進(jìn)一步用上臂外部引物pa3 和下臂內(nèi)部引物 pa2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增鑒定，ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 可 擴(kuò) 得2 229 bp 的 片 段，ΔcrpΔcyaC78-1 可擴(kuò)得3 717 bp 的片段，而pREΔasd無(wú)法擴(kuò)出任何條帶(圖1C)。此時(shí)所得到的菌株呈氯霉素敏感蔗糖抗性(CmsSUCr)。由此表明，ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 構(gòu)建成功。

圖1 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1PCR 鑒定Fig.1 PCR identification of ΔcrpΔcyaΔasdC78-1

圖2 PCR 鑒定ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)Fig.2 PCR identification of ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA 3493)

圖3 C500，ΔcrpΔcyaC78-1 和ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA 3493)在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of C500，ΔcrpΔcyaC78-1 and ΔcrpΔcya ΔasdC78-1(pYA3493)on medium

2.2 重組菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的構(gòu)建與鑒定 首先用引物pa2/pa3 可擴(kuò)增出2 229 bp左右的目的片段，說(shuō)明asd 基因在染色體上發(fā)生了缺失，即該菌株為ΔcrpΔcyaΔasdC78-1。其次，該菌株能夠在不含DAP 的LB 固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明含asd 基因的互補(bǔ)質(zhì)粒pYA3493 成功表達(dá)了二氨基庚二酸，即pYA3493被成功導(dǎo)入了ΔcrpΔcya ΔasdC78-1。由此可知ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA-3493)構(gòu)建成功。

圖4 PCR 鑒定Δasd 缺失片段的穩(wěn)定性Fig.4 PCR identification of stability of Δasd mutant

圖5 C500、ΔcrpΔcyaC78-1 與 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of C500，ΔcrpΔcyaC78-1 and ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)

2.3 重組菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的生物學(xué)特性

2.3.1 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的表型鑒定ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 的血清型與ΔcrpΔcyaC78-1和疫苗株C500 相同，均為6，7:C:1，5。疫苗株C500 在含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈紅色菌落，可利用麥芽糖，而ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)和ΔcrpΔcyaC78-1 保持一致，均不能利用麥芽糖，在含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈無(wú)色菌落，且在LB 固體平板上成光滑透明的乳白色菌落(圖3)。生化試驗(yàn)結(jié)果表明，ΔcrpΔcya ΔasdC78-1 (pYA3493)利用碳源的能力與ΔcrpΔcyaC78-1 基本相同，但與C500 相比，只保留了利用葡萄糖的能力，不能夠完全利用半乳糖，完全失去了利用麥芽糖、木糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇的能力(表2)。

2.3.2 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)asd 缺失型片段及質(zhì)粒 pYA3493 的遺傳穩(wěn)定性將ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3494)在LB 液體培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接60 代，取第10、20、30、40、50、60 代菌液為模板用引物pa1/pa2 PCR 擴(kuò)增鑒定，均可擴(kuò)增出315 bp 的缺失型片段，而ΔcrpΔcyaC78-1 則擴(kuò)出1 803 bp 的完整型片段(圖 4)，由此表明ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3494)能夠穩(wěn)定遺傳315 bp 的asd 缺失型片段。該菌株能夠在不含DAP 的LB 液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)，說(shuō)明質(zhì)粒起到了營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)的作用，連續(xù)傳代過(guò)程中質(zhì)粒未發(fā)生丟失。

表2 C500，ΔcrpΔcyaC78-1 和ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)生化特性比較Tab.2 Comparison of biochemical characteristics of C500，ΔcrpΔcyaC78-1 and ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)

表3 重組菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 (pYA3493)、ΔcrpΔcyaC78-1 及疫苗株C500 的口服攻毒結(jié)果Tab.3 Oral infection results of ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 (pYA3493)，ΔcrpΔcyaC78-1 and C500

2.3.3 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)、ΔcrpΔcya C78-1 及疫苗株C500 的生長(zhǎng)特性 調(diào)整三者菌液起始濃度至1×106CFU/ml，37℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔1 h 取100 μl 菌液適當(dāng)稀釋涂板，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，繪制三者生長(zhǎng)曲線。由生長(zhǎng)曲線可以看出，ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3494)的生長(zhǎng)速度略慢于ΔcyaΔasdC78-1，且二者明顯慢于疫苗株C500。見(jiàn)圖5。

2.3.4 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的毒力測(cè)定 由表3 可知，口服感染 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的 LD50 是 7.62 × 1012CFU，ΔcrpΔcyaC78-1 的LD50 是5.95×1012CFU，C500 的LD50 是 1.85 × 1010CFU，ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的半數(shù)致死量約為C500 的412 倍。

3 討論

首先，自殺性質(zhì)粒作為一種構(gòu)建精確缺失株的有效載體具有以下特性:(1)自殺性質(zhì)粒含有缺陷型R6K 復(fù)制子。該復(fù)制子只有在由pir 基因編碼的π 蛋白存在的條件下才能復(fù)制，而大腸桿菌χ7213轉(zhuǎn)導(dǎo)有可反式提供π 蛋白的含pir 基因的λ 原噬菌體，故自殺性質(zhì)?？稍讦?213 中復(fù)制，而不能在不含λpir 的細(xì)菌中復(fù)制。只有當(dāng)自殺性質(zhì)粒通過(guò)第一次同源重組整合至宿主菌的染色體上，才能通過(guò)其氯霉素抗性篩選到陽(yáng)性接合子。(2)自殺性質(zhì)粒含有RK2 的轉(zhuǎn)移起始區(qū)(mobRK2)，該區(qū)域具有潛在的誘動(dòng)能力，為其通過(guò)同源重組的方式進(jìn)入受體菌提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。(3)自殺性質(zhì)粒同時(shí)含有正向選擇基因Cm 和負(fù)向選擇基因SacB。SacB 編碼了果聚糖蔗糖酶，該酶催化蔗糖生成了一種可致死革蘭氏陰性菌的有毒化合物即果聚糖［7］。實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)，按照傳統(tǒng)的篩選步驟，在第二步篩選的過(guò)程中，陽(yáng)性接合子在含DAP 和5%蔗糖的NB(不含NaCl的LB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，其實(shí)還存在第三種情況，即陽(yáng)性接合子未發(fā)生第二次同源重組，故需要連續(xù)傳代才有可能篩選出asd 缺失株。因此將蔗糖的濃度由5%提升至10%，可快速提高第二次同源重組的效率，大大縮短篩選的時(shí)間。即不需要連續(xù)傳代，僅在第一代就可以快速篩選出asd 基因缺失菌株。

其次，菌株的選擇。在我國(guó)，預(yù)防仔豬副傷寒的標(biāo)準(zhǔn)弱毒疫苗株是C500。疫苗株C500 是由抗原性良好的豬霍亂沙門菌強(qiáng)度株C78-1 經(jīng)化學(xué)誘變的方法得到，田間和區(qū)域試驗(yàn)均證明安全有效，在全國(guó)推廣使用取得了可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。故趙戰(zhàn)勤［8］在疫苗株C500 的基礎(chǔ)上構(gòu)建了ΔasdC500 平衡致死系統(tǒng)。為克服疫苗株C500 毒力致弱背景不清且留有殘毒的缺陷，張明亮［9］構(gòu)建了ΔcrpΔasd C78-1 平衡致死系統(tǒng)，其毒力較疫苗株C500 下降了約1.5 倍，但本文所使用的缺失株ΔcrpΔcyaC78-1其毒力(腹腔攻毒)較疫苗株C500 下降顯著，約103倍［2］，且該類雙缺失株在國(guó)外的同類研究中也已被證明保留有較好的免疫原性，故相對(duì)于疫苗株C500而言，缺失株ΔcrpΔcyaC78-1 可能更適合用于開發(fā)攜帶外源基因的口服活疫苗載體。

1992 年，田京慧等［10］構(gòu)建了重組鼠傷寒沙門菌ΔcyaΔcrpΔasd χ4072(pYA-ctxB)，成功表達(dá)了霍亂毒素B 亞單位基因，口服該菌株對(duì)傷寒和霍亂毒株均有良好的免疫力。2003 年，白楊等［11］構(gòu)建了重組減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔcyaΔasd χ4072(pYA-248AB)，成功表達(dá)了幽門螺桿菌(Hp)黏附素保守區(qū)(AB)，口服該重組菌株其致死劑量是野生株χ3181 的103倍［11］。2011 年，穆沛紅等［12］構(gòu)建了表達(dá)E 型腦炎病毒的重組減毒鼠傷寒沙門菌活載體疫苗ΔcrpΔcyaΔasdχ4550(pYA-3341-E)，該重組菌能夠穩(wěn)定表達(dá)乙型腦炎病毒E 蛋白，口服該疫苗能夠誘發(fā)特異性的細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)。以上文獻(xiàn)均表明以crp、cya、asd 三基因構(gòu)建的減毒鼠沙門菌平衡致死系統(tǒng)可以作為活疫苗載體高效表外源基因。同理，可以此三基因構(gòu)建減毒豬霍亂沙門菌平衡致死系統(tǒng)用于外源基因的表達(dá)。本文所構(gòu)建的豬霍亂沙門菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)其血清型、生長(zhǎng)速度、生化特性、毒力均與ΔcrpΔcyaC78-1 基本相同，說(shuō)明將互補(bǔ)質(zhì)粒pYA3493 電轉(zhuǎn)化至缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 后沒(méi)有改變其生物學(xué)特性。小鼠口服攻毒實(shí)驗(yàn)表明本文所構(gòu)建的豬霍亂沙門菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)其半數(shù)致死量約為疫苗株C500 的412 倍，可見(jiàn)缺失上述基因構(gòu)建平衡致死系統(tǒng)其毒力下降非常明顯。

綜上所述，本文通過(guò)基因工程所構(gòu)建的減毒豬霍亂沙門菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)平衡致死系統(tǒng)其毒力較疫苗株C500 降低顯著，安全性較高，不存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，且遺傳及致弱背景清晰，故有潛力作為高效表達(dá)外源基因的口服活疫苗載體。

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