馮 佳 向 陽 夏 燕 蔡 杰 陳安平 楊年安 龔書識 劉冬梅 袁 林

(湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，恩施 445000)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是由多種原因引起的嚴(yán)重肺間質(zhì)慢性疾病。主要病理特點(diǎn)表現(xiàn)為早期的彌漫性肺泡炎、間質(zhì)性肺炎、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致后期的大量成纖維細(xì)胞病理性增生和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，可引起呼吸衰竭，死亡率高達(dá)50%～70%［1］。肺纖維化的治療以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為主，但其療效不顯著，而且長期大劑量服用副作用大。近年來中醫(yī)藥在防治肺纖維化方面做了大量研究，并取得一定的成果，顯示了良好的前景［2］。益氣養(yǎng)陰方是本院臨床上治療肺纖維化的經(jīng)驗(yàn)方，臨床實(shí)踐證明其能夠較好地改善患者的癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。本課題組前期已證實(shí)益氣養(yǎng)陰方能夠降低肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織中TGF-β1 的含量，達(dá)到延緩肺纖維化的作用［3］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察益氣養(yǎng)陰方對博來霉素所致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用及對Smad2、Smad7 表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討其治療肺纖維化的作用機(jī)制，為益氣養(yǎng)陰方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.1 動(dòng)物 健康清潔級雄性SD 大鼠60 只，體重為(230±10)g，購自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號:SCXK(鄂)2008-0005。

1.1.2 主要試劑 益氣養(yǎng)陰方(板黨、北沙參、麥冬、五味子、黃芪、石斛、遠(yuǎn)志、川牛膝、竹節(jié)參、金銀花等)由湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院藥劑科提供，制備成含生藥1 g/ml 的溶劑;博來霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;醋酸潑尼松片由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn);兔IgG-SABC 免疫組化染色試劑盒、大鼠Smad2 和Smad7 免疫組化一抗、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模 健康雄性SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥組、激素組、中藥+激素組5 組，每組12 只。除正常組外，余組大鼠以10%水合氯醛按3.5 ml/kg 腹腔麻醉，取仰臥位固定，頸部常規(guī)消毒，切開頸部皮膚，逐層鈍性分離暴露氣管，用注射器于環(huán)狀軟骨間刺入氣管內(nèi)，緩慢注入博來霉素(5 mg/kg)，注射完畢后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥物在肺內(nèi)均勻分布。正常組大鼠按上述方法經(jīng)氣管注入等量生理鹽水。從造模后第2 天開始給藥，給藥劑量根據(jù)成人與動(dòng)物體重劑量換算而成。中藥組給予益氣養(yǎng)陰方1 ml/100 g 灌胃;激素組給予35%醋酸潑尼松溶液按1 ml/100 g 體重灌胃;中藥+激素組給予中藥加激素混合溶液按1 ml/100 g灌胃;正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。均每日1 次，連續(xù)給藥28 d。于實(shí)驗(yàn)第28 天處死所有大鼠。完整分離出肺組織，取左肺下葉于10%中性甲醛中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，行HE 染色及免疫組化檢測。

1.2.2 肺組織病理學(xué)檢查 顯微鏡下觀察HE 切片，參照Hubner 等［4］方法確定肺纖維化程度。0級:正常肺;1 級:單個(gè)肺泡呈輕微纖維樣變厚(肺泡壁厚度小于正常3 倍);2 級:明顯肺泡纖維化，伴有小纖維灶形成(肺泡壁厚度大于正常3 倍);3 級:連續(xù)的肺泡纖維化區(qū)域(肺泡壁厚度大于正常3 倍);4 級:單個(gè)的纖維灶(面積小于10%);5 級:纖維灶融合(面積大于10%，且小于50%);6 級:大量連續(xù)纖維灶(面積大于50%);7 級:肺結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)肺大皰;8 級:出現(xiàn)纖維性閉塞，肺組織全部纖維化。參照Szapiel 等［5］方法確定肺泡炎程度.0 級:無明顯肺泡炎改變;1 級:輕度肺泡炎，肺泡間隔有少量炎性細(xì)胞浸潤，病變范圍小于全肺20%;2 級:中度肺泡炎，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯增寬，病變范圍占全肺的20%～50%;3 級:重度肺泡炎，肺泡融合，大量炎性細(xì)胞浸潤，膠原纖維沉積，病變范圍大于全肺50%。將等級資料轉(zhuǎn)化為計(jì)量資料，1級計(jì)1 分，每組10 個(gè)樣本分別評分，求平均值。

1.2.3 肺組織中Smad2、Smad7 表達(dá)的檢測 石蠟組織切片常規(guī)脫蠟水化，3%雙氧水滅活內(nèi)源性酶，然后進(jìn)行熱修復(fù)抗原，滴加5%BSA 封閉液封閉，棄血清，分別滴加按1 ∶100 稀釋的Smad2 及Smad7 一抗(兔IgG)4℃過夜，滴加生物素化羊抗兔二抗，再滴加SABC 試劑，DAB 顯色后，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗。胞漿呈清晰棕黃色為陽性，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，觀察陽性表達(dá)的定位并用Image-Pro Plus6.0 圖像分析系統(tǒng)測定目標(biāo)區(qū)域的平均光密度值(OD 值)，作為Smad2、Smad7 蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)使用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，以±s 表示，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間兩兩比較，LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣養(yǎng)陰方對肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)的影響

2.1.1 外觀形態(tài)觀察 正常組大鼠肺外觀未見明顯異常，表面光滑、色澤粉嫩、質(zhì)地柔軟、富有彈性。模型組大鼠肺顏色暗淡，有散在出血點(diǎn)，表面凹凸不平，局部可見大小不等灰白色結(jié)節(jié)，部分區(qū)域呈蒼白色，質(zhì)地較硬，肺組織彈性差，切面呈彌漫性實(shí)變。激素組大鼠肺表面有小片狀凹凸不平，呈暗紅色，程度較模型組輕，表面光滑，彈性較好;中藥組大鼠肺外觀與正常組大鼠相近，部分呈暗紅色，質(zhì)地均勻，彈性良好，無實(shí)變表現(xiàn)。中藥+激素組大鼠肺硬度稍增加，未見明顯實(shí)變，表面欠光滑，局部有散在小結(jié)節(jié)，但總體好于激素組。

2.1.2 HE 染色組織病理學(xué)觀察 光鏡下正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，肺泡間隔無水腫，無炎性細(xì)胞浸潤;模型組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，大部分肺泡萎陷、破壞，肺泡間隔增寬并伴有炎性細(xì)胞浸潤，大量膠原纖維沉積，毛細(xì)血管腔明顯增厚，部分閉塞;激素組肺泡大小不等，少量肺泡萎陷，間隔有膠原沉積，程度較模型組輕;中藥組、中藥+激素組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡間隔厚度及炎細(xì)胞浸潤較模型組明顯減輕，成纖維細(xì)胞及膠原沉積減少，其中以中藥組大鼠肺組織纖維化程度減輕更為明顯所示，見圖1。

2.1.3 各組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級結(jié)果模型組大鼠肺泡炎和肺纖維化程度評分明顯高于正常組(P＜0.01)，說明肺組織損傷嚴(yán)重，肺纖維化造模成功;激素組肺組織病理評分較模型組有所減少(P＜0.05);中藥組、中藥+激素組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度與模型組相比減輕(P ＜0.01 或P ＜0.05)，以中藥組肺損傷減輕更為明顯，見表1。

2.2 益氣養(yǎng)陰方對肺纖維化大鼠肺組織Smad2 和Smad7 蛋白表達(dá)的影響 正常組Smad2 蛋白未見明顯表達(dá);模型組肺泡上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞胞漿中Smad2 蛋白高表達(dá)，且表達(dá)量明顯高于正常組(P＜0.01);與模型組相比，激素組、中藥組、中藥+激素組Smad2 陽性表達(dá)均減少(P＜0.05 或P＜0.01)，以中藥組表達(dá)量最低(P＜0.01);中藥組分別與激素組、中藥+激素組相比，Smad2 蛋白表達(dá)均具有顯著差異(P＜0.01);中藥+激素組Smad2 蛋白表達(dá)較激素組有所減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常組Smad7 蛋白在肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞胞漿中大量表達(dá);模型組Smad7 蛋白較正常組明顯減少(P＜0.01);與模型組相比，激素組、中藥組、中藥+激素組Smad7 蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P ＜0.05 或P＜0.01)，以中藥組表達(dá)量最高(P＜0.01);中藥組分別與激素組、中藥+激素組相比，Smad7 蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01 或P＜0.05)，見表2 及圖2、3。

表1 各組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級(±s)Tab.1 Extent of alveolitis and pulmonary fibrosis in rats of different groups(±s)

表1 各組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級(±s)Tab.1 Extent of alveolitis and pulmonary fibrosis in rats of different groups(±s)

Note:Compared with model group，1)P＜0.05，2)P＜0.01.

表2 各組大鼠Smad2 和Smad7 蛋白表達(dá)平均光密度值(±s)Tab.2 Average optical density of Smad2 and Smad7 protein in rats of different groups(±s)

表2 各組大鼠Smad2 和Smad7 蛋白表達(dá)平均光密度值(±s)Tab.2 Average optical density of Smad2 and Smad7 protein in rats of different groups(±s)

Note:Compared with model group，1)P＜0.05，2)P＜0.01;compared with YQYY group，3)P＜0.05，4)P＜0.01;compared with hormone group，5)P＞0.05.

圖1 各組大鼠肺組織(HE 染色，×400)Fig.1 Lung tissue of rats in each group (HE staining，×400)

圖2 各組大鼠Smad2 蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×200)Fig.2 Protein expression of Smad2 in each group (immunohistochemical staining，×200)

圖3 各組大鼠Smad7 免疫組化染色(免疫組化染色，×200)Fig.3 Protein expression of Smad7 in each group (immunohistochemical staining，×200)

3 討論

肺纖維化是一種慢性彌漫性肺間質(zhì)炎癥性疾病，以成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)沉積為其主要病理特征，導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)的異常重塑，最終呼吸衰竭而死亡［6］。

自Thrall 等［7］發(fā)現(xiàn)向大鼠氣管內(nèi)注入小劑量博來霉素可致大鼠肺間質(zhì)纖維化，并且其病理過程與人類肺纖維化相似，氣管內(nèi)灌注博來霉素已成為建立肺纖維化動(dòng)物模型的經(jīng)典方法。本實(shí)驗(yàn)在造模28 天后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織表面凹凸不平，部分區(qū)域呈蒼白色，質(zhì)地較硬，并且光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，大部分肺泡萎陷、破壞，肺泡間隔增寬并伴有炎性細(xì)胞浸潤，大量膠原纖維沉積，而且模型組大鼠肺泡炎和肺纖維化程度評分明顯高于正常組，說明肺組織損傷嚴(yán)重，提示肺纖維化造模成功。肉眼觀察中藥組與正常組大鼠肺組織相近，鏡下可見肺組織結(jié)構(gòu)大體完整，肺泡炎及肺纖維化程度顯著低于模型組。激素組、中藥+激素組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度與模型組相比有所減輕，但效果不及中藥組，表明經(jīng)益氣養(yǎng)陰方治療后的大鼠肺組織損傷有明顯改善，提示該方具有減輕或抑制大鼠肺纖維化的作用。

肺纖維化的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確，涉及多信號通路調(diào)控及多因子相互作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是促進(jìn)纖維化的主要細(xì)胞因子，被公認(rèn)為與肺纖維化的發(fā)生和形成關(guān)系最為密切［8］。TGF-β1 促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞過度增殖、分化，繼而促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)和肺泡間過度積聚，導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展［9］。課題組前期證實(shí)肺纖維化大鼠肺組織內(nèi)TGF-β1 含量顯著增多，益氣養(yǎng)陰方能夠降低TGF-β1，減少肺組織成纖維細(xì)胞生成，達(dá)到緩解肺纖維化的目的。TGF-β/Smad信號通路是參與肺纖維化上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Smad 是細(xì)胞內(nèi)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，是TGF-β的下游底物，在肺纖維化信號通路中發(fā)揮重要作用［10］。Smad 蛋白分為受體活化型或通路限制性Smad(RSmads)、共同通路型Smad(Co-Smad)和抑制性Smad(ISmads)3 個(gè)亞家族，包括9 種Smad 蛋白。Smad2 屬于RSmads，其磷酸化激活是Smad 信號通路激活的重要標(biāo)志之一，磷酸化的Smad2 與Smad4 結(jié)合形成復(fù)合體，激活胞核內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)一系列反應(yīng)，促進(jìn)纖維化的形成［11］。Smad7 屬于I-Smad，是TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要抑制性調(diào)控蛋白。研究發(fā)現(xiàn)阻斷Smad7 內(nèi)源性表達(dá)可抑制肺上皮細(xì)胞的發(fā)育，增加肺組織羥脯氨酸含量，促進(jìn)肺組織纖維化程度，提示Smad7 蛋白表達(dá)情況與肺纖維化關(guān)系密切［12］。采取藥物干預(yù)Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程及其關(guān)鍵信號分子表達(dá)己成為近年來研究抗肺纖維化的一個(gè)熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)染色法檢測大鼠肺組織Smad2、Smad7 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)激素、中藥、中藥+激素組均能減少Smad2 蛋白表達(dá)，以中藥組表達(dá)量最低;與模型組相比，激素組、中藥組、中藥+激素組Smad7 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，以中藥組表達(dá)量最高。使用激素治療的目的主要是抑制炎癥，但在肺纖維化中后期，肺成纖維細(xì)胞過度增殖，肺組織結(jié)構(gòu)異常重塑，激素治療效果不佳，而且長期使用副作用大，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也是一致的。說明益氣養(yǎng)陰方能有效抑制TGF-β 下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子Smad2 的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)發(fā)揮抑制性調(diào)控效應(yīng)的Smad7表達(dá)增加，證實(shí)益氣養(yǎng)陰方通過影響TGF-β/Smad 信號通路來干預(yù)治療大鼠肺纖維化。

綜上，益氣養(yǎng)陰方對博來霉素所致大鼠肺纖維化具有干預(yù)治療作用，其機(jī)制與抑制炎癥反應(yīng)、減少膠原蛋白的形成和沉積及干預(yù)TGF-β/Smad 信號通路有關(guān)。

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