李 翔 何躍平 劉 勝 羅晶晶 劉 碩 張紫柔 姚 雯 張 艷

(南華大學病原生物學研究所，衡陽 421001)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)致癌作用與胃黏膜炎癥反應密切相關［1］。多種細胞因子介導H.pylori 感染相關的炎癥反應，其中Interleukin-1beta (IL-1β) 和 Interleukin-18 (IL-18)在H.pylori 感染胃黏膜標本中的過度分泌已有報道［2-5］。體外細胞共培養(yǎng)試驗亦表明，H.pylori 能刺激樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)、巨噬細胞和單核細胞 分 泌IL-1β 和IL-18［4，6，7］。然 而，目 前 關 于H.pylori 感染導致這兩種細胞因子產(chǎn)生的機制尚不明確。新近研究發(fā)現(xiàn)，一種胞漿NOD 樣受體(NODlike receptor，NLR)——NLRP3 炎癥復合體(Inflammasome)能夠識別多種病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及內源性危險信號，通過活化胱天蛋白酶(caspase)-1，調控IL-1β、IL-18 和IL-33 等促炎細胞因子的加工及活化，參與天然免疫系統(tǒng)的激活［8，9］。活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是目前公認的激活NLRP3 炎癥復合體的關鍵分子之一［10］。本研究以人單核細胞THP-1 來源的巨噬細胞與H.pylori 為共培養(yǎng)模型，采用RNA 干擾等方法，探討H.pylori 是否通過激活NLRP3 炎癥復合體誘導IL-1β 和IL-18的產(chǎn)生及ROS 在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 H.pylori SS1 菌株為本實驗室保存;人單核細胞THP-1 細胞購于上海中科院細胞庫;哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司;羊血購自貝瑞特生物公司;RPMI1640 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司;胎牛血清購自四季青生物工程材料公司;Real-time PCR 所 用 引 物、TRIZOL 試 劑、UltraSYBR Mixture 購于北京康為世紀公司;LPS(E-.coli O55:B5)、乙酰半胱氨酸(NAC)、二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)購于Sigma 公司;人IL-1β ELISA 試劑盒購于武漢博士德生物公司;人IL-18 ELISA 試劑盒購于北京欣博盛生物公司;一抗(兔抗-caspase-1)購于CST 公司;二抗(羊抗兔IgG)購于Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌-細胞共培養(yǎng)模型的建立及分組 收集對數(shù)生長期THP-1 細胞，按1×106個細胞/孔將細胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔加入1 ml 培養(yǎng)液，加入終濃度為100 nmol/L 的佛波酯(PMA)在恒溫箱(37℃、5% CO2)中孵育48 h，誘導分化為巨噬細胞。用無菌PBS(pH7.2)收集哥倫比亞血瓊脂平板上的H.pylori 菌體，調整菌液濃度至1×109CFU/ml。按照不同感染復數(shù)(MOI，細菌數(shù):細胞數(shù))200 ∶1、100 ∶1、50 ∶1、25 ∶1加入H.pylori 菌液刺激，共培養(yǎng)0、3、6、12、24 h 后用慶大霉素殺死胞外的細菌，收集培養(yǎng)上清及細胞用于后續(xù)實驗。同時設立陰性對照(僅用培養(yǎng)基培養(yǎng))及陽性對照(100 ng/ml LPS 處理)。

1.2.2 ELISA 檢測共培養(yǎng)細胞上清中IL-1β、IL-18含量［11］采用雙抗體夾心法，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 FCM 檢測胞內ROS 水平 THP-1 細胞分組同前，設立對照組，每孔設3 個平行孔，用H.pylori刺激THP-1 細胞3、6、12、24 h。去除培養(yǎng)基，加入1 ml 濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育30 min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。收集各時間點細胞，上流式細胞儀(FCM)檢測熒光的強弱(激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm)。

1.2.4 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測細胞中NLRP3、caspase-1 mRNA 的表達 于不同時間點收集共培養(yǎng)細胞，TRIZOL 法提取細胞總RNA，逆轉錄后采用SYBR Green Ⅰ染料法進行Real-time PCR。反應條件:95℃10 min，95℃15 s，60℃ 1 min，共40 個循環(huán)。分析基因擴增的平均Ct 值，以GAPDH 為內參(174 bp)，按照公式2-ΔΔct進行相對定量計算。各種基因引物序列及擴增產(chǎn)物大小見表1。

表1 各基因引物序列及擴增產(chǎn)物大小Tab.1 Primers sequences and size of amiplification products

1.2.5 Western blot 檢測細胞中活性caspase-1 的表達 細胞分組及處理同前，提取細胞總蛋白并定量后按常規(guī)操作步驟進行［11］。caspase-1 和β-actin 一抗終濃度均為1 ∶1 000。實驗重復3 次。

1.2.6 NAC 預處理對NLRP3、caspase-1 mRNA 表達及細胞因子分泌的影響 設未清除組和清除組，每組設3 個平行孔。清除組將25 mmol/L ROS 清除劑NAC 加至細胞培養(yǎng)板中孵育30 min，之后兩組細胞用H.pylori 刺激3、6、12、24 h，收集培養(yǎng)上清及細胞，進行Real-time PCR、ELISA 檢測。

1.2.7 NLRP3-siRNA 對H.pylori 誘導的IL-1β 和IL-18 分泌的影響 查找人NLRP3 mRNA 基因序列，根據(jù)siRNA 的設計原則設計引物(Sense:5'-GGUGUUGGAAUUAGACAAC-3';Antisense:5'-GUUGUCUAAUUCCAACACC-3')并交由廣州銳博生物科技有限公司合成。實驗分為3 組:①野生組(WT組，未干擾組);②control-siRNA 組(陰性干擾序列對照組:Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，Antisense:ACGUGACACGUUCGGAGGAGAATT);③NLRP3-siRNA 組。6 孔板中PMA 誘導THP-1 細胞分化為巨噬細胞;用Opti-MEM 培養(yǎng)基按1 ∶50(v/v)分別稀釋Lipofectamine 2000 和siRNA(儲存液濃度:20 μmol/L)，再將二者稀釋液按照1 ∶1(v/v)輕輕混勻，室溫靜置20 min 以形成siRNA-Lipofectamine 2000 混合液;將500 μl 混合液加入各孔并將培養(yǎng)基補足到2 ml，細胞置培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Real-time PCR 確認干擾效果。siRNA 轉染后24 h 用H.pylori 刺激，于12 h 收集細胞培養(yǎng)上清，ELISA 檢測細胞因子含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 SPSS18.0 軟件分析。實驗數(shù)據(jù)以±s 表示，組內采用獨立樣本t 檢驗，組間均數(shù)比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結果

2.1 H.pylori 誘導THP-1 細胞分泌IL-1β 和IL-18 不同MOI 的H.pylori 刺激THP-1 細胞12 h，能以劑量依賴性方式誘導細胞產(chǎn)生IL-1β 和IL-18。當MOI 為100 ∶1 時細胞因子的產(chǎn)生達最大值，但當MOI 為200 ∶1 時，細胞因子產(chǎn)生減少(結果未顯示)，故選用MOI 為100 ∶1進行后續(xù)試驗。與陰性對照(正常THP-1 細胞)相比，H.pylori 刺激能顯著增加IL-1β 和IL-18 的含量，二者分別在6、12 h 達到最高(圖1A、B)。

2.2 H.pylori 誘導THP-1 細胞產(chǎn)生胞內ROS 與陰性對照相比，H.pylori 刺激導致DCF 熒光值增加，于刺激后6 h 達到高峰(圖2)，提示H.pylori 能誘導胞內ROS 的產(chǎn)生。

2.3 H.pylori 增加THP-1 細胞NLRP3、caspase-1 mRNA 的表達 Real-time PCR 結果(圖3)表明，H.pylori 刺激能增加THP-1 細胞NLRP3、caspase-1 mRNA 的表達，NLRP3 和caspase-1 mRNA 均于3 h開始升高，6 h 達到高峰。

2.4 H.pylori 誘導THP-1 細胞caspase-1 活化 Western blot 結果顯示(圖4)，H.pylori 刺激組可檢測到caspase-1 p10 (10 kD)亞單位的產(chǎn)生，其表達在3 h 開始升高，6 h 達到最高，NAC 作用后各組含量都下降。

圖1 H.pylori 誘導THP-1 細胞產(chǎn)生IL-1β 和IL-18Fig.1 H.pylori induced production of IL-1β and IL-18 in THP-1 cells

圖2 H.pylori 誘導THP-1 細胞后ROS 的熒光強度值Fig.2 Mean fluorescence intensity values of ROS in THP-1 cells induced by H.pylori

圖3 Real-time PCR 檢測細胞中NLRP3 和caspase-1 mRNA 的表達Fig.3 Expression of NLRP3 and caspase-1 mRNA detected by Real-time PCR

圖4 Western blot 檢測各組THP-1 細胞中caspase-1 蛋白的表達Fig.4 Expression of caspase-1 protein in THP-1 cells detected by Western blot

2.5 NAC 預處理對NLRP3、caspase-1 mRNA 表達及細胞因子分泌的影響 如圖5 所示，NAC 預處理THP-1 細 胞30 min 明 顯 降 低H.pylori 誘 導 的NLRP3 和caspase-1 mRNA 的表達;NAC 預處理同樣抑制了H.pylori 誘導的IL-1β、IL-18 的產(chǎn)生(圖6)，提示ROS 在H.pylori 誘導的NLRP3 炎癥復合體激活中發(fā)揮著重要作用。

圖5 NAC 對H.pylori 誘 導 的THP-1 細 胞NLRP3、caspase-1 mRNA 表達的影響Fig.5 Effects of NAC on NLRP3 and caspase-1 mRNA expression in THP-1 cells induced by H.pylori

圖6 NAC 對H.pylori 誘導的THP-1 細胞分泌細胞因子的影響Fig.6 Effects of NAC on cytokines secretion from THP-1 cells induced by H.pylori

2.6 NLRP3-siRNA 對H.pylori 誘導的IL-1β 和IL-18 分泌的影響 與WT 組及control-siRNA(ctrlsiRNA)組相比，NLRP3-siRNA 明顯抑制了NLRP3 mRNA 表達(圖7)。在用H.pylori 刺激的情況下，NLRP3-siRNA 組IL-1β 和IL-18 的含量與對照組相比都有所降低，分別減少30.08%、58.94%(圖8A、B)。

圖7 NLRP3-siRNA 對THP-1 細胞NLRP3 mRNA 表達水平的影響Fig.7 Effects of NLRP3-siRNA on NLRP3 mRNA expression in THP-1 cells

圖8 NLRP3-siRNA 對H.pylori 誘導THP-1 細胞產(chǎn)生IL-1β 和IL-18 的影響Fig.8 Effects of NLRP3-siRNA on IL-1β and IL-18 production in H.pylori-infected THP-1 cells

3 討論

促炎細胞因子在H.pylori 致病和疾病進展(如胃癌)中發(fā)揮著重要作用［1］。已有研究報道，H.pylori 感染陽性胃黏膜標本中促炎細胞因子，如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等的表達高于H.pylori 陰性者［2-5，12］。IL-1β 具有廣泛的生物學效應，可在局部或全身發(fā)揮作用，如發(fā)熱、參與炎癥反應等。IL-1β與IL-1RⅠ結合，通過一系列激酶磷酸化步驟激活NF-κB、MAPK 途徑，從而促進炎癥相關基因表達［2，3］。IL-1β 和IL-18 能夠增加其他細胞因子如IL-6 和TNF-α 的表達，上調黏附分子的表達并促進炎性細胞的滲出［2-5］。已有研究表明，H.pylori 能誘導DC、巨噬細胞和單核細胞分泌IL-1β 和IL-18［4，6，7］，但其機制尚不明確。IL-1β 和IL-18 的加工和分泌需要caspase-1 的活化，而caspase-1 活化受到胞內多蛋白復合物——NLRP3 等炎癥復合體的調控［9］。不少研究證實，NLRP3 炎癥小體是引發(fā)各種炎癥反應的新機制，在多種病毒、細菌、真菌感染性炎癥以及痛風、關節(jié)炎、動脈粥樣病變等非感染性炎癥的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮了重要作用［8-10］。

關于NLRP3 炎癥復合體在抗H.pylori 感染中的作用目前已有少量報道。Benoit 等［13］的研究表明，ASC 基因缺失小鼠宿主免疫反應降低、H.pylori定植增多，提示ASC 參與H.pylori 感染的免疫應答，但H.pylori 是否以NLRP3 和ASC 協(xié)同依賴性的方式誘導caspase-1 的活化和IL-1β 分泌及其活化機制尚不清楚。H.pylori 能夠在體內及體外培養(yǎng)的DC 中活化caspase-1，誘導IL-1β 和IL-18 的成熟和分泌［14］。最近的一項研究顯示，H.pylori 感染小鼠DC 經(jīng)NLRP3 炎癥復合體激活caspase-1 而誘導成熟IL-1β 的分泌［15］。我們的前期研究亦發(fā)現(xiàn)，H.pylori 感染C57BL/6 小鼠胃黏膜組織中NLRP3信號通路相關分子表達增高，提示NLRP3 炎癥復合體可能參與H.pylori 的防御與清除［11］。

巨噬細胞在H.pylori 感染引起的炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用［16］。例如，來自于H.pylori 感染兒童胃黏膜活檢標本中存在大量巨噬細胞的浸潤，巨噬細胞數(shù)量與IL-1β、IL-18 等細胞因子轉錄水平及胃炎嚴重性密切相關［17］。本研究結果顯示:H.pylori 能夠激活THP-1 源性巨噬細胞NLRP3 炎癥復合體，并以時間和劑量依賴性方式誘導THP-1細胞產(chǎn)生IL-1β 和IL-18，這兩種細胞因子的分泌增多可能與NLRP3 炎癥復合體活化有關。

NLRP3 炎癥小體的激活需要兩個信號［18］。首先需要由信號1 促進NLRP3 的轉錄，使其表達量增加到足以激活炎癥小體，這個信號可以由一些先天性免疫受體、細胞因子受體等提供，通過NF-κB 途徑促進NLRP3 以及IL-1β 前體(pro-IL-1β)的轉錄;接著在信號2(如:ROS 產(chǎn)生、鉀離子外流及組織蛋白酶B 釋放等)的刺激下，NLRP3 與ASC 以及caspase-1 組裝成炎癥小體，并導致成熟IL-1β 的切割和釋放。

H.pylori 能夠誘導胞內ROS 的產(chǎn)生，這可能是H.pylori 感染導致宿主損傷的重要機制之一［19，20］。本研究結果表明:H.pylori 能夠誘導THP-1 細胞產(chǎn)生胞內ROS，NAC 預處理顯著抑制H.pylori 誘導的NLRP3 炎癥復合體成份的表達以及這兩種細胞因子的產(chǎn)生，提示ROS 在H.pylori/NLRP3 活化/細胞因子分泌軸中發(fā)揮著重要的作用。進一步的研究結果表明:NLRP3 基因沉默明顯抑制了H.pylori 誘導的IL-1β 和IL-18 分泌，表明NLRP3 是H.pylori 誘導細胞因子產(chǎn)生所必需。

綜上所述，本研究顯示H.pylori 通過激活NLRP3 炎癥復合體誘導THP-1 細胞分泌IL-1β 和IL-18;ROS 是H.pylori 誘導NLRP3 炎癥復合體活化的關鍵上游信號。NLRP3 炎癥小體在H.pylori 感染炎癥反應中的具體作用機制仍不清楚，NLRP3 如何識別H.pylori、如何觸發(fā)炎癥反應以及該過程是否涉及兩種或多種激活途徑的協(xié)同作用尚待深入研究。

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