孫曉琳 謝基明 云小樂 張 威 康鴻斌 萬永青 劉竟然 鞏 培 趙世敏 王玉珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特 010018)

內(nèi)毒素(Endotoxin)是G-菌及其他微生物(立克次體，衣原體等)細胞壁外膜中的重要組成部分，它的化學本質(zhì)為脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，可被TLR4 識別。TLR4 介導的LPS 誘導信號傳導途徑包括MyD88 依賴性和MyD88 非依賴性兩個途徑［1］。在與LPS 結合后，TLR4 招募接頭分子MyD88，激活IL-1 受體相關激酶(IRAK)所介導的NF-κB 和MAPK 通路，啟動TNF-α、IL-1、IL-6 等炎癥因子的轉錄及翻譯［2］。此外，MEK1/ERK1 途徑活化促使誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，催化產(chǎn)生大量NO，參與內(nèi)毒素性大鼠的組織損傷過程［3］。

Rab 蛋白在GTP 結合的活性形式和GDP 結合的非活性形式之間轉換［4］，調(diào)控著囊泡轉運的各個環(huán)節(jié)，參與信號轉導過程［5］。Rab5a 參與了調(diào)控胞吞過程中胞吞泡與早期內(nèi)體的融合，是早期胞吞途徑中一個重要的限速成分。Rab5a 不但參與細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、蛋白質(zhì)分選，而且還與信號轉導和細胞骨架重建等功能密切相關。例如:Rab5 和Rab7 可與交叉提呈的MHCⅠ類分子肽復合物共聚。Rab5 參與表皮生長因子(EGFR)的信號轉導;過表達失活突變的Rab5S34N 阻斷了通過EGFR 活化引起的Raf-ERK1/2 信號通路以及細胞的增殖［5］。

本實驗以小鼠單核/巨噬細胞株RAW264.7 作為細胞模型，研究過表達Rab5a 對LPS 刺激的巨噬細胞中iNOS、TNF-α 和IL-6 表達的變化。在此基礎上，進一步探討Rab5a 在TLR 信號轉導中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 小鼠巨噬細胞RAW 264.7(購自北京協(xié)和細胞庫)，胎牛血清(購自蘭州民海生物有限公司)，DMEM 培養(yǎng)基(購自美國Gibco 公司)，MTT 和LPS (均為美國Sigma 公司產(chǎn)品)，反轉錄試劑盒、Taq 酶，Real-Time PCR mix(均為寶生物公司產(chǎn)品)，Lipofectamine 2000 試劑(Invitrogen 公司)，iNOS 測定試劑盒(南京建成生物公司)，TRIZOL、G418(均為康為世紀公司產(chǎn)品)。真核表達載體Rab5a 為本實驗室保存。Rab5aN133I 質(zhì)粒是將Rab5a 蛋白第133 位的天冬酰胺(N)突變?yōu)楫惲涟彼?I)，該突變表現(xiàn)為GTP 結合能力下降，因而稱為失活突變［6］。

1.2 小鼠巨噬細胞株RAW 264.7 的培養(yǎng) RAW 264.7 細胞株混懸后接種于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 d 換液或傳代一次。

1.3 細胞轉染 細胞計數(shù)，將RAW264.7 巨噬細胞(105個/孔)接種于6 孔板中，5%CO2、37°C 過夜培養(yǎng)。1 μg 真核表達質(zhì)粒(pcDNA3.1、pcDNA3.1/mRab5a、pcDNA3.1/tRab5a)分別與3 μl Lipofectamine 2000 試劑混和，室溫作用20 min，以形成質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物，隨即將復合物加入待轉染的細胞中，轉染后4～6 h 換液。48 h 后加G418(800 μg/ml)作用3 周，篩選穩(wěn)定表達的細胞株，采用Real-Time PCR 驗證相應的篩選結果。

1.4 Real-time PCR TRIZOL 法提取細胞的總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。1 μg RNA 反轉錄cDNA。以sence 5'-GAGCAACAAGACCCAACG-3' 和 antisence 5'-ATGATACCGTTCTTGACC-3'為Rab5a 的Real-Time PCR 引物。檢驗已轉染細胞株是否穩(wěn)定表達。Real-Time PCR 通過ABI 7300 (Applied Biosystems，USA)和the SYBR RTPCR kit 進行分析。同樣方法檢測iNOS、TNF-α、IL-6 的表達情況，文中使用的引物序列見表1。

1.5 MTT 法測基因轉染對RAW264.7 細胞的影響細胞計數(shù)，將三種轉染細胞以相同量(103個/每孔)接種與96 孔板，設3 個復孔。5～6 h 貼壁后血清饑餓12 h 開始計時，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，到達時間點加入MTT(0.5 mg/ml)，37℃，5%CO2培養(yǎng)4 h 后每孔加入150 ml DMSO，低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀用OD490 nm 檢測。

1.6 iNOS 含量測定 細胞計數(shù)，將三種轉染細胞以相同量(105個/每孔)接種于24 孔板，設3 個復孔。LPS/Poly I:C 刺激6 h 和18 h，按照iNOS 測定試劑盒測定iNOS 含量。

1.7 細胞因子TNF-α、IL-6 含量測定 采用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(R＆D)定量分析細胞培養(yǎng)上清中TNF-α 和IL-6 的含量。

1.8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0 軟件進行分析，P＜0.05 時認為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 穩(wěn)定表達Rab5a 細胞系的鑒定 篩選穩(wěn)定表達的細胞株后，我們通過Real-time PCR 檢測細胞株是否穩(wěn)定轉染，結果如圖1 所示，Rab5a 過表達質(zhì)粒穩(wěn)定轉染細胞和Rab5a 突變過表達質(zhì)粒轉染細胞的Rab5a 表達量明顯大于空質(zhì)粒轉染細胞。以上結果說明穩(wěn)定表達Rab5a 的細胞系已經(jīng)成功建立。

2.2 MTT 檢測轉染細胞生長趨勢 從MTT 測定的細胞生長曲線(圖2)中可以看出，過表達Rab5a 質(zhì)粒轉染細胞第2 天進入指數(shù)生長期，而Rab5aN133I突變質(zhì)粒轉染細胞和空質(zhì)粒轉染細胞第3 天開始進入指數(shù)生長期，并且Rab5a 質(zhì)粒轉染細胞的生長速率明顯高于Rab5aN133I 突變質(zhì)粒轉染細胞和空質(zhì)粒轉染細胞。根據(jù)以上結果推測，Rab5a 的過表達促進細胞生長。

表1 本實驗中使用的引物序列Tab.1 Primers used in experiment

2.3 LPS 刺激下iNOS 表達水平檢測 巨噬細胞受到LPS 刺激時，可激活細胞內(nèi)ERK 激酶，并促使誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等的表達，催化產(chǎn)生大量NO，NO 參與殺滅微生物并介導一系列免疫病理過 程［3］。我們通過Real-TimePCR對iNOS的mRNA水平進行了檢測(圖3A)。又通過iNOS 檢測試劑盒檢測了iNOS 的蛋白分泌量(圖3B)。如圖所示，在LPS刺激后，穩(wěn)定表達Rab5a和Rab5aN113I 的細胞中iNOS 含量均隨刺激時間增加而增加。其中，過表達Rab5a 顯著促進了LPS 介導iNOS 的生成。而Rab5aN113I 細胞中iNOS 的mRNA 與蛋白水平與對照組相比都沒有顯著增高。

2.4 Rab5a 促進RAW264.7 細胞中LPS 誘導的TNF-α 的表達 NO 的過量生成與炎癥密切相關，TNF-α、IL-6、IL-1等都能活化巨噬細胞，誘導iNOS的表達，進一步產(chǎn)生NO。我們隨后檢測了Rab5a對巨噬細胞中TNF-α 表達的影響。利用Real-Time-PCR 對TNF-α 的mRNA 水平進行了檢測(圖4A)。采用ELISA 的方法檢測了TNF-α 的蛋白分泌量(圖4B)。結果表明 Rab5a 過表達顯著促進了RAW264.7 細胞中LPS 誘導的TNF-α 的生成。與穩(wěn)定表達Rab5a 的細胞相比，穩(wěn)定表達Rab5aN113I的細胞中LPS 刺激產(chǎn)生的TNF-α 表達量顯著下降。

2.5 Rab5a 促進RAW264.7 細胞中LPS 誘導的IL-6 的表達 同樣，通過Real-Time PCR 和ELISA 試劑盒對IL-6 的表達量分別從mRNA 水平和蛋白分泌量層面進行了檢測(圖5A、B)。LPS 刺激2、8 和16 h，過表達Rab5a 細胞中IL-6 mRNA 水平均明顯高于轉染空質(zhì)粒細胞和失活突變細胞(圖5A)。通過ELISA 試劑盒檢測，LPS 刺激12 h 和24 h，過表達Rab5a 細胞上清中IL-6 明顯高于轉染空質(zhì)粒細胞和失活突變細胞(圖5B)。

圖1 穩(wěn)定轉染細胞Rab5a 的表達水平Fig.1 Detection of Rab5a expression in stable cell lines

圖2 MTT 法測定穩(wěn)定轉染細胞生長趨勢Fig.2 Determination of growth trends of stably transfected cells by MTT assay

圖3 LPS 刺激不同時間iNOS 表達測定Fig.3 Expression of iNOS after stimulation with LPS at different times

圖4 Rab5a 對LPS 刺激RAW264.7 細胞中TNF-α 表達的影響Fig.4 Effects of Rab5a on LPS-induced TNF-α expression in RAW264.7 cells

圖5 Rab5a 對LPS 刺激RAW264.7 細胞中IL-6 表達的影響Fig.5 Effects of Rab5a on LPS-induced IL-6 expression in RAW264.7 cells

3 討論

Rab5a 是Rabs 蛋白的一個成員，具有GTP 酶活性［7］，近年來，許多研究表明，Rab5a 不僅參與轉運囊泡的運輸過程，而且通過調(diào)控一些膜受體的轉運間接調(diào)控受體介導的信號轉導［8］。我們成功建立了穩(wěn)定表達Rab5a 和Rab5aN113I 突變巨噬細胞系。有研究表明Rab5a 基因與腫瘤細胞的生長和凋亡有關，Rab5a 對巨噬細胞的生長的影響未見報道。從MTT 實驗結果推斷Rab5a 基因過表達后，RAW264.7 的生長速率明顯提高，據(jù)此推測Rab5a 促進了RAW264.7 生長。

NO 參與了體內(nèi)眾多生理、病理過程，包括免疫調(diào)節(jié)、松弛平滑肌、神經(jīng)遞質(zhì)及細胞毒作用等［9］，還能引起細胞外基質(zhì)成分的改變，進而調(diào)節(jié)血管生成［10］。在本實驗中，我們采用Real-Time PCR 的方法動態(tài)檢測了Rab5a 過表達細胞在LPS 刺激0、2、8、16 h 后iNOS mRNA 水平的變化。結果表明，在LPS 刺激后2 h，Rab5a 就開始促進iNOS mRNA 的表達，這種促進作用在6 h 達到高峰，16 h 后開始下降(圖3A)。為了進一步驗證Rab5a 對LPS 刺激的巨噬細胞中iNOS 表達的調(diào)控，我們又采用了iNOS檢測試劑盒從蛋白水平檢測了iNOS 的表達變化。因為蛋白的表達滯后于mRNA 的表達，我們選擇了LPS 刺激后6 和18 h 來驗證iNOS mRNA 在LPS 刺激后2 和8 h 的表達。結果表明，Rab5a 也促進了iNOS 蛋白的表達(圖3B)。

同樣的，我們檢測了Rab5a 過表達后LPS 刺激的RAW264.7 細胞中TNF-α 和IL-6 的影響。從圖4A 可以看出，Rab5a 在LPS 刺激后2 h 就顯著地促進了LPS 誘導的TNF-α mRNA 的表達，在8 h 達到高峰，16 h 稍有下降。我們想知道，Rab5a 的這種促進作用是否持久，所以選擇了在12 h 和24 h 檢測TNF-α 的分泌水平。結果表明，在LPS 刺激后24 h，Rab5a 仍能促進TNF-α 的表達(圖4B)。對IL-6的檢測結果表明，巨噬細胞中Rab5a 以時間依賴性的方式促進LPS 誘導的IL-6 的表達(圖5)。細胞因子可以促進iNOS 的表達，我們推測Rab5a 可能通過促進TNF-α 和IL-6 的表達來促進iNOS 的表達。

Rab 蛋白具有GTP 酶活性，能夠在GTP 結合的活性形式和GDP 結合的非活性形式之間轉換。本實驗成功構建了GTP 酶活性缺失的Rab5a 突變體N133I。實驗結果表明，Rab5a 失活突變基因的表達阻斷了Rab5a 對IL-6、TNF-α、iNOS 等炎性介質(zhì)的表達。該結果說明，Rab5a 發(fā)揮作用依賴其GTP 結合能力。有研究表明，Rabs 家族成員Rab7b 和Rab7參與TLRs 信號通路且負向調(diào)控NO 產(chǎn)生和TLRs 信號通路［11-14］，但是Rab5a 是否參與調(diào)控TLRs 的信號通路，并未見報道。我們的研究顯示，Rab5a 參與了LPS 誘導的炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。我們以前的研究表明，Rab7b 可以通過轉運TLR4 到溶酶體進行降解，從而負向調(diào)控了TLR4 的信號轉導［12］。Rab5a促進LPS 誘導細胞因子的表達的是否通過其囊泡轉運功能來實現(xiàn)有待進一步研究。

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