張 維 許鵬祥 錢世鹍 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，廣州 510260)

Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)家族是病原相關(guān)模式識(shí)別受體，在協(xié)調(diào)先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均起到重要調(diào)節(jié)作用［1］。Toll 樣受體在免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，包括單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B 細(xì)胞和T 細(xì)胞等細(xì)胞的表面，在移植過程中可以通過與外源性配體(如入侵的病原體)或者細(xì)胞損傷釋放自身內(nèi)源性配體結(jié)合的方式而被激活［2-5］。Toll 樣受體信號(hào)在移植生物學(xué)中發(fā)揮多方面作用，如排斥反應(yīng)、免疫耐受、缺血/再灌注損傷(IRI)和移植后感染［6-9］。我們通過建立大鼠皮膚移植急性排斥反應(yīng)模型，并與正常大鼠生理穩(wěn)態(tài)相比較，檢測(cè)Toll 受體在外周免疫器官脾臟中單個(gè)核細(xì)胞的mRNA 和脾臟組織中Toll受體蛋白的表達(dá)水平和特點(diǎn)，探討Toll 受體表達(dá)與器官移植急性排斥反應(yīng)的關(guān)系，尋找臨床診療的潛在途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)別Sprague-Dawley(SD)大鼠，Wistar 大鼠，均為8 周齡雄性大鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要儀器與試劑 大鼠Toll 受體mRNA 檢測(cè)試劑盒、Trizol 購于日本TaKaRa 公司;Nycodenz 粉劑購于挪威Axis-shield 公司，按說明用PBS 液配成14.5%濃度梯度離心液;使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)合成引物(表1:大鼠Toll 受體合成引物序列)，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成;大鼠Toll 受體蛋白檢測(cè)抗體購于武漢博士德生物工程有限公司;實(shí)時(shí)定量熒光Roche 480 PCR 儀(美國Roche 公司);自動(dòng)石蠟標(biāo)本包埋機(jī)(江蘇常州中威電子儀器有限公司，BMJ-Ⅲ型);病理組織切片機(jī)(德國Leica 公司，Leica2235 型);光學(xué)顯微鏡(日本NIKON ECLIPSE 55i 型)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及建立模型 隨機(jī)分為4 組，A 組為同種異基因組，B 組為同種同基因組，C 組為假手術(shù)組，D 組為正常對(duì)照組，每組6 只。A 組供體為Wistar 大鼠，SD 大鼠作為受體，B 組供體為SD 大鼠，受體為另一只SD 大鼠，C 組為SD 大鼠自體皮膚移植原位縫合，各組大鼠均未作特殊處理。取供體大鼠背部中間偏上區(qū)剪取郵票大小的全厚背部皮膚移植到受體制備移植組模型。

1.4 標(biāo)本的獲取及檢測(cè) 手術(shù)后大鼠全部存活，分別在術(shù)后第1、4、7、10、14、21 天時(shí)間點(diǎn)取各組大鼠1 只，脫臼處死大鼠后，無菌操作取出脾臟，留取小部分脾臟用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片后用于免疫組化檢測(cè)組織Toll 受體蛋白表達(dá)，顯微鏡下觀察圖片呈淡黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆分別表示弱陽性(+)、中等陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++);另大部分脾臟用14.5%Nycodenz-PBS 密度梯度離心液提取出單個(gè)核細(xì)胞，再用Trizol 一步法提取RNA 行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)其Toll 受體mRNA 表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)用±s 表述，組間比較采用單因素方差分析，采用S-N-K 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠移植皮片存活情況 A 組大鼠移植皮片在術(shù)后3～4 d 左右開始出現(xiàn)脫水、干燥，皮膚質(zhì)地變硬，7 d 后移植皮片出現(xiàn)邊緣翹起，部分區(qū)域變黑，10 天時(shí)出現(xiàn)移植皮片變黑、變硬，面積稍縮小，14 d 時(shí)出現(xiàn)皮片面積縮小約60%，在第21 天時(shí)移植皮片表皮層從真皮層分離、脫落。B 組大鼠移植皮片在術(shù)后4 d 時(shí)色澤紅潤，彈性好，柔軟，7～8 d 時(shí)邊緣稍干燥，14 d 時(shí)皮片基本愈合，21 d 皮片少許毛發(fā)生長。C 組大鼠移植皮片術(shù)后第7 天紅潤、柔軟，第14 天時(shí)移植皮片愈合，并出現(xiàn)少部分毛發(fā)，21 d 時(shí)移植皮片與周圍色澤一致，毛發(fā)基本長滿。A 組大鼠移植皮片出現(xiàn)嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，B 組移植皮片呈免疫耐受狀態(tài)，C 組皮片術(shù)后愈合良好，綜上所述，各組大鼠移植皮片排斥反應(yīng)程度與Toll 受體的表達(dá)檢測(cè)情況趨勢(shì)上基本一致。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞Toll受體mRNA 表達(dá) 與正常大鼠為參數(shù)的D 組比較，21 d 實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)各實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M(A 組、B 組、C 組)TLR4、TLR9、TLR10 的mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)水平變化顯示一定趨勢(shì)性;A 組整體水平升高，而B組、C 組整體水平降低;A 組與B 組、C 組比較，TLR4、TLR9、TLR10 mRNA 表達(dá)的水平均存在明顯差異(P＜0.05)，B 組與C 組之間無差異(P ＞0.05)。提示A 組中TLR4、9、10 三者mRNA 在術(shù)后脾臟中表達(dá)呈現(xiàn)整體升高趨勢(shì)，而TLR4 的相對(duì)表達(dá)水平顯得更為靈敏，TLR9、10 的升高則比較平穩(wěn)。

表1 大鼠Toll 受體合成引物序列Tab.1 Primer sequence of rat Toll like receptor

TLR4 及TLR9 mRNA 水平變化存在趨向一致的時(shí)相特點(diǎn)，A 組中TLR4、TLR9 mRNA 都于術(shù)后第1 天開始上升;TLR4 mRNA 于第7 天稍有回落，而TLR9 mRNA 于第10 天稍有回落;之后二者再次升高，并于第21 天達(dá)峰值。而B 及C 組均于術(shù)后第1天下降，B 組在第7 天達(dá)最低值，C 組在第4 天達(dá)最低值，在第10 天重新出現(xiàn)上升并于第21 天回落到低值。A 組中TLR10 mRNA 的表達(dá)水平在移植術(shù)后第1 天升高不明顯，在第4 天繼續(xù)升高，之后逐漸平穩(wěn)升高，在第21 天達(dá)峰值(表2～4:大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞TLR4、9、10 mRNA 的表達(dá);圖1～3:大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞TLR4、9、10 mRNA 的表達(dá))。

表2 大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA 的表達(dá)Tab.2 Expression of TLR4 mRNA in spleen mononuclear cell

表3 大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞TLR9 mRNA 的表達(dá)Tab.3 Expression of TLR9 mRNA in rat spleen mononuclear cell

表4 大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞TLR10 mRNA 的表達(dá)Tab.4 Expression of TLR10 mRNA in rat spleen mononuclear cell

圖1 大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA 的表達(dá)Fig.1 TLR4 mRNA expression in rat spleen mono-nuclear cell

圖2 大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞TLR9 mRNA 的表達(dá)Fig.2 TLR9 mRNA expression in rat spleen mononuclear cell

2.3 免疫組化檢測(cè)大鼠脾臟組織Toll 受體蛋白的表達(dá) A 組中TLR4、9、10 三者的蛋白表達(dá)水平均明顯強(qiáng)于B、C、D 組;后三者之間表達(dá)水平基本相同，呈現(xiàn)淡黃色顆粒(+)。A 組中TLR4、9、10 的蛋白表達(dá)水平在術(shù)后第1 天至第14 天呈現(xiàn)棕黃色顆粒(++)，第21 天呈現(xiàn)褐黃色粗顆粒(+++)。A組Toll 受體蛋白水平的升高與其mRNA 的表達(dá)水平相比升高趨勢(shì)基本一致(圖4～6:免疫組化檢測(cè)移植大鼠脾臟組織TLR4、9、10 蛋白表達(dá);圖7:免疫組化檢測(cè)正常大鼠TLR4、9、10 蛋白表達(dá))。

圖3 大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞TLR10 mRNA 的表達(dá)Fig.3 TLR10 mRNA expression in rat spleen mononuclear cell

圖4 免疫組化檢測(cè)移植大鼠脾臟TLR4 蛋白表達(dá)(×400)Fig.4 Immuno-histochemistry was adopted to test transplanted rat's spleen TLR4 protein expression(×400)

圖5 免疫組化檢測(cè)移植大鼠脾臟TLR9 蛋白表達(dá)(×400)Fig.5 Immuno-histochemistry was adopted to test transplanted rat's spleen TLR9 protein expression(×400)

圖6 免疫組化檢測(cè)移植大鼠脾臟TLR10 蛋白表達(dá)(×400)Fig.6 Immuno-histochemistry was adopted to test transplanted rat's spleen TLR10 protein expression(×400)

圖7 免疫組化檢測(cè)正常大鼠脾臟TLR4、9、10 蛋白表達(dá)(×400)Fig.7 Immuno-histochemistry was adopted to test normal rat's spleen TLR4，9 and 10 protein expression(×400)

3 討論

Toll 樣受體是存在于機(jī)體內(nèi)的一類重要的模式識(shí)別受體，可識(shí)別病原體表達(dá)的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)并與其結(jié)合，使Toll 樣受體通過髓樣分化因子88(MYD88)途徑啟動(dòng)信號(hào)通路，誘導(dǎo)NF-κB活化，從而使抗原提呈細(xì)胞(APCs)開始成熟，并持續(xù)增加共刺激分子和其他促炎癥細(xì)胞因子的釋放，激活初始T 細(xì)胞來啟動(dòng)免疫應(yīng)答［10，11］。這種信號(hào)通路途徑在Th1 細(xì)胞針對(duì)微生物抗原的免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用［12］，因此TLR 信號(hào)通路使免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別體內(nèi)入侵的病原體和調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答［13］，這些發(fā)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)防御入侵的病原體相一致［14］。故對(duì)Toll 樣受體的研究有助于闡明免疫系統(tǒng)與急性排斥反應(yīng)的本質(zhì)，越來越多的研究也證實(shí)其在移植免疫和免疫系統(tǒng)失衡的治療中提供新的思路。

采用Wistar 大鼠為供體、SD 大鼠為受體的同種異體皮膚移植可作為建立急性排斥反應(yīng)模型之一，能在術(shù)后引起急性排斥反應(yīng)發(fā)生。本研究通過Wistar 和SD 大鼠建立皮膚移植模型，檢測(cè)Toll 樣受體的表達(dá)情況。利用RT-PCR 和免疫組化對(duì)大鼠外周免疫器官脾臟單個(gè)核細(xì)胞中TLR4、9、10 的檢測(cè)結(jié)果均表明mRNA 和蛋白表達(dá)水平增加;說明TLR4、TLR9、TLR10 都參與了排斥反應(yīng);并且各自表達(dá)時(shí)間先后上還存在一定差異性，我們推測(cè)其參與排斥反應(yīng)的先后可能不同。目前該方面研究大部分是針對(duì)移植效應(yīng)器官進(jìn)行單個(gè)或者兩個(gè)TLR 樣受體研究，本研究以外周免疫調(diào)節(jié)器官脾臟為目標(biāo)，對(duì)脾臟中的TLR4、9、10 的表達(dá)情況進(jìn)行同步研究，這些對(duì)于闡明TLR 在脾臟中參與移植排斥的免疫調(diào)節(jié)，以及協(xié)同機(jī)制可能會(huì)有較好的幫助。

急性移植排斥反應(yīng)是器官移植術(shù)后主要的并發(fā)癥，是一系列免疫分子參與的復(fù)雜免疫過程。一些研究表明TLR4 能被內(nèi)源性配體如熱休克蛋白、硫酸類肝素、表面活性物質(zhì)等激活，并有研究證實(shí)在移植排斥反應(yīng)中這些配體的表達(dá)增加了，可能的機(jī)制為通過配體激活TLR4，使TLR4 通過髓樣分化因子88(MYD88)途徑啟動(dòng)信號(hào)通路來參與移植排斥反應(yīng)［15-20］。TLR9、10 在急性排斥反應(yīng)中的研究較少，兩者在移植排斥反應(yīng)中的作用不太清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4、9、10 在A 組大鼠外周免疫器官脾臟中表達(dá)水平升高，提示TLR4、9、10 均參與急性排斥反應(yīng)，但是否促進(jìn)移植免疫排斥反應(yīng)尚難確定;同時(shí)TLR4、9、10 在表達(dá)時(shí)相上存在一定差異性。另外，雖然無急性排斥的同基因移植組(B 組)與假手術(shù)組(C 組)數(shù)據(jù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其TLR4、9、10mRNA 表達(dá)水平隨時(shí)間變化存在一定波動(dòng)性。因此，我們認(rèn)為需進(jìn)一步探索的機(jī)制是:TLR4、9、10 參與急性排斥反應(yīng)過程中是否存在序貫性特點(diǎn);并且除MYD88 信號(hào)通路之外是否還存在其他信號(hào)通路。脾臟是淋巴細(xì)胞遷移和接受抗原刺激后發(fā)生免疫應(yīng)答、產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子的重要場(chǎng)所，如果能分選其中抗原遞呈功能最強(qiáng)大的樹突狀細(xì)胞來檢測(cè)Toll樣受體的表達(dá)則可以更好地闡釋兩者在移植免疫中的作用。

綜上所述，我們認(rèn)為TLR4、9、10 可以在器官移植排斥反應(yīng)中被激活，導(dǎo)致適應(yīng)性免疫應(yīng)答的發(fā)生，探索移植術(shù)后抑制Toll 樣受體的激活可能為防治急性排斥反應(yīng)的發(fā)生提供新的治療靶點(diǎn)。

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