沈 輝 朱玉強(qiáng) 孔 永 王 婧 朱華亭 於葛華 蔡 磊 朱 瑩 王志瑤 邱玉華

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系，蘇州 215123)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種常見的自身免疫疾病，主要表現(xiàn)為T、B 淋巴細(xì)胞功能異常，產(chǎn)生多種自身抗體，形成免疫復(fù)合物以及多種組織器官損傷和功能喪失，其中狼瘡樣腎炎(LN)是SLE 最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是導(dǎo)致SLE 患者死亡的主要原因之一。T 細(xì)胞的過度活化與SLE 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，T 細(xì)胞活化需要兩個不同的信號，第一信號來自于抗原肽-MHC 復(fù)合物與T 細(xì)胞受體(TCR)的相互作用，第二信號為共刺激信號。B7-1(又稱CD80)是APC 表面重要的共刺激分子，其受體為T細(xì)胞表面CD28 家族分子，兩者結(jié)合后可介導(dǎo)T 細(xì)胞的活化、增殖與分化［1］，從而引發(fā)機(jī)體的細(xì)胞與體液免疫。

B7-1 抗體可通過競爭結(jié)合B7/CD28 信號通路中的B7-1 分子，從而削弱或阻斷共刺激信號，降低機(jī)體的免疫應(yīng)答［2］。鼠源性抗體由于其在體內(nèi)運(yùn)用易產(chǎn)生人抗鼠抗體(Human anti-mouse antibody，HAMA)，造成效價降低及引發(fā)過敏等后果。采用基因工程將鼠源抗體的可變區(qū)與人Ig 恒定區(qū)拼接而成的人-鼠嵌合抗體可降低HAMA 反應(yīng)［3］，延長半衰期。此類抗體一方面具有鼠源抗體Fab 段高親和力結(jié)合抗原的特性，另一方面又具有人源Fc 段介導(dǎo)的ADCC 效應(yīng)［4］、CDC 效應(yīng)及免疫調(diào)理作用等。本研究在自行成功研制了B7-1 人-鼠嵌合抗體的基礎(chǔ)上，旨在運(yùn)用化學(xué)法建立類似人類狼瘡樣腎炎的小鼠模型［5］，觀察抗體對病理損傷的改善作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 6 周齡雌性C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量25～30 g(蘇州大學(xué)實(shí)驗動物中心)，降植烷(2，6，10，14-tetramethylpentadecane，Pristane)(Sigma，美國)，PE-羊抗人IgG(Fc)mAb(R＆D，美國)，Albustix尿蛋白試紙(Bayer，美國)，抗核抗體(ANA)檢測試劑盒(北京和杰創(chuàng)新生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，中國)，F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG 抗體(Jackson，美國)，分泌B7-1 人鼠嵌合抗體的細(xì)胞株CHO-ch4E5(本單位建株、保存［6］)。

1.2 方法

1.2.1 B7-1 人鼠嵌合抗體的制備及純化 取分泌B7-1 人鼠嵌合抗體的細(xì)胞株于無血清培養(yǎng)基中，滾瓶培養(yǎng)，待6～7 d 后收集上清，經(jīng)高速離心和超濾濃縮，采用ProteinG 親和層析柱分離純化，Lowry 法定量，過濾除菌，分裝于-80℃保存。

1.2.2 B7-1 人鼠嵌合抗體對細(xì)胞模型B7-1 分子的識別 將細(xì)胞株L929-mock、L929-B7-1 經(jīng)PBS 洗滌，分別加入B7-1 人鼠嵌合抗體(5 ×105/50 μl)，4℃孵育45 min，充分洗滌后加入PE-羊抗人IgG(Fc)mAb，4℃孵育45 min，充分洗滌后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析。

1.2.3 小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及生物學(xué)鑒定取6 周齡、雌性C57BL/6J 小鼠，予一次性腹腔注射Pristane 0.5 ml/只。逐月定時檢測血清ANA 及尿蛋白水平。待出現(xiàn)異常時取部分小鼠做腎臟HE染色，觀察病理學(xué)改變。待小鼠出現(xiàn)較高含量的抗核抗體、尿蛋白及較嚴(yán)重的腎臟病理學(xué)改變即視為模型建立成功。

1.2.4 蛋白尿含量的測定 以建模日起每月1 次定時測定尿蛋白，采用Albustix 試紙法。依據(jù)反應(yīng)區(qū)顯色程度判斷尿蛋白含量(-):0 mg/L;(±):150～300 mg/L;(+):300 mg/L;(++):1 000 mg/L;(+++):3 000 mg/L;(++++):＞20 000 mg/L。

1.2.5 血清ANA 抗體水平的測定 每月定時采集血清，經(jīng)免疫熒光法進(jìn)行定量。具體操作按ANA 檢測試劑盒說明書進(jìn)行。血清稀釋后，在HEP 細(xì)胞片反應(yīng)區(qū)室溫孵育30 min，設(shè)陰、陽性對照。經(jīng)洗滌后再與FITC-羊抗鼠抗體避光室溫孵育30 min，經(jīng)洗滌，封片置于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果判定:(-):無熒光;(+):熒光強(qiáng)度很弱;(++):熒光中等亮度;(+++):熒光強(qiáng)度較強(qiáng);(++++):與陽性對照同等亮度。

1.2.6 腎臟病理學(xué)改變的觀察 取尿蛋白及ANA水平出現(xiàn)異常的部分小鼠，取腎臟經(jīng)10%福爾馬林固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片及HE 染色。置于光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的病理學(xué)改變。同時分析其與尿蛋白及ANA 水平的相關(guān)性。

1.2.7 抗體對小鼠疾病模型的免疫干預(yù) 取模型鼠隨機(jī)分為3 組，每組5 只?？贵w干預(yù)組:于實(shí)驗的第1、3、5、8、15、43、71、99 天分別經(jīng)眼眶靜脈注射抗體，200 μg/只［7］;模型組:給予等劑量的人同型IgG;陽性對照組:于第1、3、5、8、15 天注射免疫抑制劑CTX，2.5 mg/只。同上法分析尿蛋白及ANA 水平的動態(tài)變化。

1.2.8 小鼠腎臟免疫復(fù)合物(IC)的檢測 注射抗體3 個月后，處死小鼠，取一側(cè)腎臟經(jīng)福爾馬林固定，乙醇脫水，石蠟包埋后切片，與FITC-羊抗鼠IgG避光孵育30 min，洗滌封片后，置于熒光顯微鏡下觀察IC 的沉積。

1.2.9 透射電鏡對腎小球內(nèi)沉積物及基底膜改變的觀察 取另一側(cè)腎臟，切成1 mm ×1 mm ×1 mm小塊，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、染色后用透射電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SAS9.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對等級資料進(jìn)行Spearman 等級相關(guān)分析;對計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 B7-1 人鼠嵌合抗體對膜型B7-1 分子的識別間接免疫熒光法經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，B7-1 人鼠嵌合抗體與細(xì)胞株L929-mock、L929-B7-1 的陽性結(jié)合率分別為0.798%、95.1%(圖1)。

2.2 小鼠模型的建立及生物學(xué)鑒定 用Pristane誘導(dǎo)2 個月時，部分小鼠出現(xiàn)尿蛋白和ANA，隨時間延長，尿蛋白含量和血清ANA 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，4個月時，尿蛋白含量為+～+++，ANA 為++～+++(表1)。此時腎小球的體積增大，炎性細(xì)胞侵潤增多(圖2)。提示此時小鼠狼瘡樣腎炎模型建立成功。結(jié)果可見尿蛋白及ANA 水平與腎臟病理學(xué)改變的嚴(yán)重程度相關(guān)，尿蛋白及ANA 均達(dá)到++及以上者視為可用于抗體干預(yù)的模型小鼠。尿蛋白及ANA 水平均在++及以上者占建模鼠總量的80%。

2.3 小鼠蛋白尿檢測 干預(yù)后逐月檢測，抗體干預(yù)組尿蛋白陽性率及含量逐漸減小，干預(yù)3 個月時，蛋白含量為±～++，而模型組尿蛋白有上升趨勢，3個月時，尿蛋白含量為++～++++，此時干預(yù)組和造模組尿蛋白出現(xiàn)的頻率和程度經(jīng)檢驗比較，有明顯差異(表2)(P＜0.01)。

圖1 B7-1 人鼠嵌合抗體對膜型B7-1 分子的識別Fig.1 B7-1 chimeric antibodies recognizing membrane molecule B7-1

2.4 血清中抗ANA 抗體的表達(dá) 干預(yù)后，抗體干預(yù)組ANA 熒光強(qiáng)度有所減弱，模型組熒光反而變強(qiáng)，3 個月時，抗體干預(yù)組和模型組熒光強(qiáng)度分別為+～++，+++～++++(見表3)。由圖3 可見，3 個月時模型組核型可見斑點(diǎn)型、核仁型和均質(zhì)型，熒光強(qiáng)度很強(qiáng)，抗體干預(yù)組熒光很弱。提示嵌合抗體對模型小鼠血清抗核抗體的抑制作用。

2.5 腎臟組織的病理學(xué)改變 干預(yù)第3 個月時腎臟病理切片H＆E 染色光學(xué)顯微鏡下觀察，造模組腎小球體積中重度增大，細(xì)胞數(shù)量增多，內(nèi)皮細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生，且可見腎小球炎性細(xì)胞侵潤，部分腎小管上皮樣細(xì)胞可見水腫樣變性、血管充血明顯，纖維組織增生?？贵w干預(yù)組腎小球體積輕中度增大，細(xì)胞數(shù)輕度增多，腎小管輕度充血，少許淋巴細(xì)胞侵潤。兩組比較，干預(yù)組腎臟病理學(xué)改變輕于造模組。陰性對照組腎臟組織無明顯病理學(xué)改變(圖4)。

表1 注射Pristane 后小鼠尿蛋白及ANA 動態(tài)變化Tab.1 Dynamic changes of mice urinary protein and ANA after injection Pristane

表2 干預(yù)后小鼠尿蛋白動態(tài)變化(n=5)Tab.2 Dynamic changes of mice urinary protein after intervention(n=5)

表3 干預(yù)后小鼠血清ANA 熒光強(qiáng)度變化(n=5)Tab.3 Fluorescence intensity change of mice in serum ANA after intervention(n=5)

2.6 腎臟組織免疫復(fù)合物熒光染色觀察 腎臟組織石蠟切片經(jīng)FITC 羊抗鼠IgG 免疫熒光染色，置于熒光顯微鏡下觀察:造模組可見較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，免疫熒光襯托出明顯的腎小球輪廓，免疫復(fù)合物沉積于腎小球系膜毛細(xì)血管襻。抗體干預(yù)組腎小球免疫復(fù)合物產(chǎn)生的熒光范圍較小，熒光強(qiáng)度較弱，腎小球輪廓較明顯，提示干預(yù)組腎小球上的IC 明顯少于造模組。陰性對照組腎小球未見熒光(圖5)。

2.7 透射電鏡對腎小球沉積物及基底膜改變的觀察 干預(yù)至3 個月時在電子顯微鏡下可見造模組腎小球基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞間有大量的電子致密物沉積，足細(xì)胞間突起廣泛融合，足突消失，沉積物在基底膜表面呈駝峰狀，基底膜增厚，提示免疫復(fù)合物在腎小球上沉積;與造模組相比，抗體干預(yù)組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞間有少量電子致密物沉積，可見正常足突，基底膜厚度較均勻(圖6)。

圖2 注射Pristane 后小鼠腎臟H＆E 染色(×400)Fig.2 Mice kidney of stained with H＆E after injection Pristane(×400)

圖3 干預(yù)3 個月時C57BL/J6 小鼠血清ANA 表達(dá)(×600)Fig.3 Expressing of ANA in C57BL/J6 mice serum 3 months after intervention(×600)

圖4 干預(yù)3 個月時C57BL/J6 小鼠腎臟H＆E 染色(×400)Fig.4 C57BL/J6 mice kidney of stained with H＆E 3 months after intervention(×400)

圖5 干預(yù)3 個月時C57BL/J6 小鼠腎臟IC 沉積情況(×400)Fig.5 Deposition of IC on kidneys of C57BL/J6 mice 3 months after intervention(×400)

圖6 干預(yù)3 個月時腎臟組織超微結(jié)構(gòu)改變的透射電鏡分析Fig.6 TEM analysis of kidney tissue ultrastructural changes 3 months after intervention

3 討論

機(jī)體正常免疫應(yīng)答過程中，B7 分子是激發(fā)有效的T 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)所必需的協(xié)同刺激分子［7］，B7 分子的配體是表達(dá)在T 細(xì)胞表面的CD28 及CTLA-4，其中B7 與CD28 的結(jié)合，提供轉(zhuǎn)導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞活化的協(xié)同共刺激信號，進(jìn)而促進(jìn)特異性T 淋巴細(xì)胞增殖。已有研究表明，B7/CD28 信號通路的過度活化與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，若缺乏B7/CD28 共刺激信號，將導(dǎo)致T 細(xì)胞的無能或者免疫耐受［8］。這顯示通過阻斷這一通路誘導(dǎo)特異性免疫耐受，可能達(dá)到對自身免疫性疾病的治療作用。

運(yùn)用B7 單克隆抗體特異性阻斷B7/CD28 信號通路來抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，鼠源性單克隆抗體由于免疫原性高，易引起人鼠抗體反應(yīng)(Human antimouse antibody，HAMA)，限制了其應(yīng)用。采用基因工程設(shè)計出的嵌合抗體(Chimeric antibody)是一種人源化的重組抗體，它是應(yīng)用DNA 重組技術(shù)將鼠源性的單克隆抗體V 區(qū)基因與人免疫球蛋白的C 區(qū)基因相連接，構(gòu)建成嵌合基因，插入適當(dāng)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染相應(yīng)宿主細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的。此類抗體的優(yōu)點(diǎn)是一方面可發(fā)揮鼠源性抗體Fab 段高親和力結(jié)合抗原的特性;另一方面，可通過人IgFc 段介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(Complement dependent cytotoxicity，CDC)［9］及免疫調(diào)理作用等。

通過建立動物疾病模型模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程及臨床表現(xiàn)是研究疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及尋找新的診治途徑的重要手段。近年來，運(yùn)用降植烷誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣模型已成為誘導(dǎo)性SLE 模型最常用的方法［10］，這種誘導(dǎo)SLE 樣綜合癥的方法較天然成模鼠有幾方面優(yōu)勢:Pristane 誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎在免疫學(xué)、組織學(xué)和病理學(xué)等方面與人類狼瘡腎炎疾病很類似，有良好的相關(guān)性。發(fā)病迅速，且小鼠來源方便，易于大量繁殖，成本低于天然成模鼠。

本研究中造模組一次性腹腔注射Pristane 0.5 ml/只，每月定期檢測小鼠的尿蛋白、ANA 及腎臟病理學(xué)改變。誘導(dǎo)4 個月時，小鼠出現(xiàn)高濃度的ANA和尿蛋白，且腎臟出現(xiàn)較嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)改變。提示小鼠尿蛋白和ANA 的產(chǎn)生與腎臟形態(tài)學(xué)改變是一致的。取尿蛋白含量達(dá)到++，ANA 熒光強(qiáng)度達(dá)到++的小鼠隨機(jī)分為3 組，抗體干預(yù)組依次注射B7-1 人-鼠嵌合抗體。尿蛋白作為腎臟受累的主要標(biāo)志，在干預(yù)后，抗體干預(yù)組尿蛋白的含量逐漸降低，由++～+++降為±～++，而模型組尿蛋白測定結(jié)果反而升高，兩組比較有明顯差異(P＜0.01)。在SLE 患者血清中95%以上都出現(xiàn)抗ANA抗體［11］，研究后期顯示抗體干預(yù)組中抗ANA 抗體的熒光強(qiáng)度和滴度要明顯低于模型組。

干預(yù)3 個月時腎臟組織病理學(xué)觀察，造模組腎臟病理學(xué)切片腎小球周圍淋巴細(xì)胞侵潤，腎小球體積中-重度增大，細(xì)胞數(shù)量增多，上皮細(xì)胞可見水腫樣變性，血管充血明顯，纖維組織增生。干預(yù)組腎小球體積輕度增大，上皮細(xì)胞水腫程度以及血管充血程度均明顯輕于造模組。免疫復(fù)合物熒光染色比較，造模組小鼠腎小球部位IC 沉積明顯，熒光強(qiáng)度強(qiáng)，可襯托出腎小球輪廓，而干預(yù)組熒光范圍小，強(qiáng)度弱。腎臟透射電鏡超微結(jié)構(gòu)分析造模組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞下有大塊電子致密物，足細(xì)胞融合，基底膜增厚，干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞間有少量電子致密物沉積，基底膜厚度較均勻。上述腎臟病理學(xué)分析均顯示干預(yù)組腎臟的病理損傷要明顯輕于造模組。

CTX(又稱環(huán)磷酰胺)是一種烷化劑，主要用于腫瘤免疫治療，可促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。近年來證實(shí)它也具有顯著的免疫抑制作用，可用于多種常見的自身免疫疾病的治療［12］。本實(shí)驗用其作為陽性對照，觀察以上指標(biāo)可以看出B7-1 人-鼠嵌合抗體對小鼠狼瘡樣腎炎模型的干預(yù)效果要比CTX 陽性對照組強(qiáng)，提示CTX 是一種非特異性免疫抑制劑，不能準(zhǔn)確進(jìn)攻靶細(xì)胞，干預(yù)效果大大降低，并且有報道證實(shí)CTX 在體內(nèi)會引起骨髓抑制、肝臟損害、出血性膀胱炎等多種副作用及不良反應(yīng)。

實(shí)驗證明，B7-1 人-鼠嵌合抗體在小鼠體內(nèi)通過阻斷B7-1/CD28 通路降低了機(jī)體免疫細(xì)胞的活化，減輕了狼瘡樣腎炎的病理學(xué)損傷，對于模型的建立具有逆轉(zhuǎn)作用，對腎炎的病變具有治療作用。目前，通過阻斷B7/CD28 共刺激信號通路來減輕機(jī)體自身免疫反應(yīng)已成為治療SLE 的新方向，而人源化的嵌合抗體具有免疫源性低，特異性強(qiáng)，體內(nèi)半衰期延長等特點(diǎn)，對于將來進(jìn)入臨床應(yīng)用，減少用藥量，降低患者的副作用等具有良好的應(yīng)用前景。

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