王子航 李春實 康勁松 米旭光 劉 磊 (延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延邊 133002)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，約80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，其中約55%發(fā)生在中國，我國每年約11 萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%［1-4］。現(xiàn)階段肝癌治療方法有了顯著進(jìn)步，但是死亡率仍高居不下，主要是因為肝癌的復(fù)發(fā)及肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移［5］。因此，尋找有關(guān)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的有效治療靶點(diǎn)和治療方法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝細(xì)胞癌SMMC-7721，人胚腎HEK293T 使用含10%胎牛血清(四季青生物公司，中國)的DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen，USA)，添加含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 主要實驗試劑耗材 Transwell 小室(Corning，美國)、基質(zhì)膠(Sigma，美國)、microRNA-199a-3p mimcs(Biomics，中國)、D-luciferin(上海科敏生物科技有限公司，中國)、PVDF 膜(Millipore，德國)、鼠抗PAK4 和HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗(CST，美國)、pRNAT-U6.1/Hygro-PAK4 干擾載體為本實驗室構(gòu)建、其他常規(guī)試劑(北京化工，中國)。

1.3 熒光素酶報告分析 pmirGLO-PAK4 3'UTR和pmirGLO-PAK4 3'UTR mut 熒光素酶報告基因載體是將人PAK4 的3'UTR 序列(或miR-199a/b-3p結(jié)合位點(diǎn)突變后的PAK4 的3'UTR 序列)克隆至pmirGLO-Firefly 熒光素酶報告基因載體中(Promega公司)。HEK293T 細(xì)胞使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，USA)轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒和miR-199a/b-3p mimcs(30 nmol/L)，48h 后檢測熒光素酶活性。

1.4 免疫印跡分析 提取細(xì)胞總蛋白后，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE 電泳轉(zhuǎn)膜，TBST 配制的脫脂奶粉封閉液封閉24 h，標(biāo)記鼠抗PAK4 一抗(1∶1 000)室溫1.5 h，TBST 清洗3 次，標(biāo)記HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗(1∶1 000)，TBST 清洗3 次，ECL 顯影。

1.5 遷移能力的檢測 在6 孔板中接種1 ×106個SMMC-7721 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 貼壁后，劃線，拍照。繼續(xù)培養(yǎng)，在24 h、48 h 時拍照，Image J 軟件分析。

1.6 侵襲能力的檢測 用無血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，饑餓24 h，然后調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×105ml-1，將200 μl 細(xì)胞懸液接種于Transwell(Transwell小室內(nèi)預(yù)鋪Matrigel 膠)小室的上室內(nèi);在24 孔板中加入600 μl 含有20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，然后將Transwell 小室放入24 孔板中;37℃5%CO2條件下培養(yǎng)24 h;取出Transwell 小室，用0.01 mol/L 的PBS 輕柔沖洗，然后用棉簽輕柔擦除上室內(nèi)黏附的細(xì)胞，在95%的乙醇中固定，最后采用結(jié)晶紫染色;在倒置顯微鏡下，隨機(jī)選擇5 個視野(×200)，觀察穿透小室的細(xì)胞數(shù)量，取其平均值，每實驗組設(shè)3 個重復(fù)，每組實驗均重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，選用成組設(shè)計的單因素方差分析。P＜0.05 差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 miR-199a/b-3p 抑制PAK4 表達(dá) 在HEK 293T 細(xì)胞中，miR-199a/b-3p mimcs 和pmir GLOPAK4 3'UTR 共轉(zhuǎn)組的熒光素酶活性顯著低于對照組(圖1)，而miR-199a/b-3p mimcs 對pmirGLOPAK4 3'UTR 突變體沒有抑制作用。在肝細(xì)胞癌SMMC-7721 細(xì)胞中，miR-199a/b-3p mimcs 轉(zhuǎn)染組內(nèi)源PAK4 蛋白表達(dá)被顯著抑制(圖2)。

2.2 miR-199a/b-3p 抑制SMMC-7721 細(xì)胞遷移侵襲 MiR-199a/b-3p mimcs 轉(zhuǎn)染24 h、48 h 后的SMMC-7721 細(xì)胞，細(xì)胞遷移率與對照相比均降低(圖3A);轉(zhuǎn)染miR-199a/b-3pmimcs可顯著抑制SMMC-7721 細(xì)胞的侵襲能力(圖3B)。

圖1 miR-199a/b-3p 抑制PAK4 3'UTR 報告基因活性Fig.1 Inhibition effect of miR-199a/b-3p on PAK4 3'UTR

圖2 miR-199a/b-3p 抑制內(nèi)源PAK4 蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of PAK4 inhibited by miR-199a/b-3p

圖3 miR-199a/b-3p 抑制SMMC-7721 遷移(A)、侵襲(B)Fig.3 Migration (A)and invasion (B)index of SMMC-7721 inhibited by miR-199a/b-3p

圖4 SMMC-7721 干擾PAK4 表達(dá)后PAK4 表達(dá)量變化(A)，干擾PAK4 抑制遷移(B)和侵襲(C)Fig.4 Expression (A)，migration (B)and invasion (C)of PAK4 in SMMC-7721 cells transfected PAK4i

2.3 干擾PAK4 表達(dá)抑制SMMC-7721 細(xì)胞遷移侵襲 在肝細(xì)胞癌SMMC-7721 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染PAK4 Si 24 h 后，檢測PAK4 蛋白表達(dá)，與對照相比PAK4 蛋白表達(dá)量顯著降低(圖4A);抑制PAK4 表達(dá)24、48 h 后的SMMC-7721 細(xì)胞，細(xì)胞遷移率與對照相比均降低(圖4B);而抑制PAK4 表達(dá)48 h 后SMMC-7721 細(xì)胞侵襲能力顯著降低(圖4C)。

3 討論

肝細(xì)胞癌死亡率在我國占惡性腫瘤死亡率的第二位。接受根治性治療的患者五年復(fù)發(fā)率可高達(dá)60%～70%，轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的主要原因［3，4］。因此，探索肝癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋求新的治療靶點(diǎn)，對于提高肝癌的療效具有重要意義。microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約為20～25 個核苷酸的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的非編碼單鏈的小分子RNA，在人類基因組中，miRNA 多聚集在與腫瘤相關(guān)的一些基因多變區(qū)以及脆性位點(diǎn)［6］，并且microRNA 可通過胞外體、微囊泡等形式由細(xì)胞主動分泌至血液中，再被受體細(xì)胞所攝取，從而調(diào)控受體細(xì)胞的功能，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7，8］。因此，miRNA 在腫瘤診斷、腫瘤分型、預(yù)后判斷及基因治療的作用越來越受到關(guān)注。

有研究顯示miR-199a/b-3p 在腎癌細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞中明顯低表達(dá)，在78%(14/18)的腎癌組織中亦明顯低表達(dá);上調(diào)miR-199a/b-3p 可顯著抑制腎癌細(xì)胞的增殖、存活和侵襲并能誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯［9，10］。而miR-199a/b-3p 在肝細(xì)胞癌(HCC)組織樣本的表達(dá)水平與正常肝組織相比顯著下調(diào)，在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中外源表達(dá)miR-199a/b-3p 可顯著抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，超表達(dá)miR-199a/b-3p可抑制肝細(xì)胞癌異種移植物體積［11，12］。由此說明miR-199a/b-3p 抑制的靶基因在HCC 的存活發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其是否對于HCC 的轉(zhuǎn)移具有抑制作用未見研究。因此，本研究擬探究miR-199a/b-3p對于HCC 轉(zhuǎn)移的影響及相應(yīng)的分子機(jī)制。在肝細(xì)胞癌SMMC-7721 中超表達(dá)miR-199a/b-3p 后，細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯下降，說明miR-199a/b-3p 具有抑制HCC 轉(zhuǎn)移的能力。并且，miR-199a/b-3p 可以下調(diào)內(nèi)源PAK4 蛋白的表達(dá)量，因此我們推測其抑制HCC 轉(zhuǎn)移侵襲可能是通過下調(diào)PAK4 實現(xiàn)的。通過干涉內(nèi)源的PAK4 表達(dá)，SMMC-7721 細(xì)胞遷移侵襲能力明顯減弱，說明miR-199a/b-3p 抑制HCC轉(zhuǎn)移，至少部分是通過靶向抑制PAK4 表達(dá)實現(xiàn)的。

［1］Bosch FX，Ribes J.Primary liver cancer:Worldwide incidence and trends［J］.Gastroenterology，2004，127(15):S5-S16.

［2］陳建國，陳萬青，張思維，等.2003-2007 年肝癌發(fā)病率與死亡率分析［J］.中華流行病學(xué)雜志，2012，33(6):547-553.

［3］王永川，魏麗娟，劉俊田，等.發(fā)達(dá)與發(fā)展中國家癌癥發(fā)病率與死亡率的比較與分析［J］.中國腫瘤臨床，2012，39(10):679-682.

［4］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61:69-90.

［5］中華人民共和國衛(wèi)生部.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011 年版)［J］.臨床肝膽病雜志，2011，27(11):1141-1160.

［6］Acunzo M，Romano G，Wernicke D，et al.microRNA and cancer-a brief overview［J］.Adv Biol Regul，2015，57:1-9.

［7］Yates LA，Norbury CJ，Gilbert RJ.The long and short of microRNA［J］.Cell，2013，153(3):516-519.

［8］Lin XJ，Chong Y，Guo ZW，et al.A serum microRNA classifier for early detection of hepatocellular carcinoma:a multicentre，retrospective，longitudinal biomarker identification study with a nested case-control study［J］.Lancet Oncol，2015，16(7):804-815.

［9］Jiang L，Cheng Q，Zhang BH.Circulating microRNAs as biomarkers in hepatocellular carcinoma screening:a validation set from China［J］.Medicine (Baltimore)，2015，94(10):e603.

［10］陶良俊，秦 超，曹 強(qiáng)，等.MicroRNA-199a-3p 在腎癌中的表達(dá)及作用［J］.現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志，2012，4(4):229-232.

［11］沈藝南，盧軍華.肝細(xì)胞病相關(guān)分子靶向治療進(jìn)展［J］.臨床肝膽病雜志，2015，31(1):130-134.

［12］李 強(qiáng)，卓其武，黃玉仙，等.從微小RNAs 看肝細(xì)胞癌診治新視點(diǎn)［J］.臨床肝膽病雜志，2015，31(6):971-981.