諶貝貝 曹惠敏 李 蓉 承歐梅 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內科，重慶 400016)

利福平是從利福霉素B 中得到的一種半合成抗生素，在神經(jīng)變性疾病的體外實驗研究中發(fā)現(xiàn)利福平能抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的炎癥相關因子TNF-α、IL-1β 和COX-2 等的產(chǎn)生，從而減輕神經(jīng)毒性，對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用［1］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，利福平對全腦缺血再灌注損傷后的保護作用尚未見報道。小膠質細胞是腦中的巨噬細胞，也是腦實質中唯一的一種免疫細胞，它們清除受損的神經(jīng)組織、吞噬微生物和細胞碎片［2，3］。小膠質細胞受到刺激以后產(chǎn)生多種炎性細胞介質如IL-1β、IL-6 和TNF-α［4，5］。越來越多的證據(jù)表明活化的小膠質細胞產(chǎn)生的毒性物質參與了腦缺血的病理生理過程［6，7］。因此，調控小膠質細胞的活化進而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應可能是治療腦缺血的重點?；谥暗捏w外實驗研究結果，我們推測，在全腦缺血再灌注損傷后利福平可能通過調控小膠質細胞活化從而抑制小膠質細胞介導的炎癥反應，進而在全腦缺血后發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因此本實驗我們通過建立大鼠全腦缺血動物模型，觀察利福平在全腦缺血中是否具有保護作用，并分析其對小膠質細胞活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠，體重250～300 g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。實驗條件下飼養(yǎng)7 d 適應環(huán)境后開始實驗。在手術前所有實驗動物禁食12 h，手術后飼養(yǎng)直至處死，飼養(yǎng)條件同手術前。

1.2 主要藥品與試劑 利福平粉針劑(維夫欣)購自重慶華邦制藥股份有限公司，以生理鹽水溶解為10 mg/ml，每次現(xiàn)配現(xiàn)用。IBA-1 單克隆抗體購自美國GENETEX 公司(貨號:GTX101495)，SABC 試劑盒購自北京中山金橋公司(貨號:SP-9000)，IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA 試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.3 實驗設計及動物分組 實驗大鼠隨機分為:假手術組(S)、全腦缺血/再灌注組(I/R)、全腦缺血/再灌注+利福平處理組(I/R+RFP)，每組14 只。I/R+RFP 組大鼠在再灌注完成后30 min，按照20 mg/kg 體重劑量給予利福平腹腔注射(i.p)，之后每日給予利福平腹腔注 射1 次(上午9 點)直至處死。假手術組及模型組在相同時間點給予等量的生理鹽水腹腔注射(i.p)。

1.4 建立大鼠全腦缺血/再灌注模型 采用雙側頸總動脈夾閉合并系統(tǒng)性低血壓建立全腦缺血/再灌注大鼠模型［8］。實驗動物經(jīng)腹腔注射3.5%的水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉后，仰臥固定，利用眼科剪在頸部做一切口，用玻璃分針游離雙側頸總動脈和右側頸總靜脈，將3F 硬膜外導管插入右側頸總靜脈至右心房，回抽血液(2.5 ml/100 g)，采用微型動脈夾夾閉雙側頸總動脈，20 min 后取下動脈夾，緩慢回輸血液，縫合手術切口，將動物放入恒溫箱直至蘇醒。假手術組動物僅分離右側頸總靜脈和兩側頸總動脈，但不夾閉雙側頸總動脈及抽取血液，余步驟同上。

1.5 石蠟組織取材 各組大鼠在術后第7 天深度麻醉后，剪開胸腔從心尖部插入灌注針至左心室，止血鉗固定針頭，然后先用生理鹽水(4℃)200 ml 沖凈腦內血液，再用4%多聚甲醛溶液(4℃)200 ml 灌注固定，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中后固定48 h，修剪腦組織后脫水包埋，在背側海馬(即前囟3.3～4.5 mm)行連續(xù)冠狀位切片，片厚4 μm，每隔9 張貼片一張，中間9 張組織切片丟棄，即每10 張切片取一張，之后行HE 及免疫組化染色。

1.6 新鮮組織取材 在術后第3 天將各組大鼠深度麻醉后斷頭處死，在冰盤上迅速取出大鼠海馬組織，錫箔紙包好后做一標記，先用液氮速凍，之后放入-80℃冰箱保存以備ELISA 檢測用。

1.7 Morris 水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶能力 建模后第7 天進行Morris 水迷宮實驗。該實驗分為兩個階段，共歷時6 d。第一階段，定位測試(定位航行實驗);第二階段，記憶能力測試(空間探索實驗)。定位測試開始前1 天讓大鼠在水池中自由游泳2 min，正式訓練時，將大鼠頭對池壁，入水點隨機選擇水池四個象限其中之一，記錄大鼠找到平臺所需的時間(即逃避潛伏期)。如果超過60 s 大鼠仍未找到平臺，引導動物至平臺上停留15 s，并將逃避潛伏期記為60 s。記憶能力測試:在實驗第6天撤除平臺，開始60 s 的記憶能力測試，記錄60 s動物在目標象限內的跨臺次數(shù)。

1.8 HE 染色觀察組織病理學形態(tài) HE 染色后，顯微鏡下觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結構變化，在制備好的石蠟切片中，每隔5 張切片取1 張，共取5張作為一套。所有切片均在400 倍下隨機取5 個非重疊視野，對各個視野的正常細胞進行計數(shù)，計算出每只大鼠海馬CA1 區(qū)每個高倍鏡視野下的平均正常細胞數(shù)。

1.9 免疫組織化學檢測IBA-1 陽性細胞數(shù)目 免疫組化SP 法檢測海馬組織IBA-1 表達(IBA-1 標記活化的小膠質細胞)，按試劑盒說明書(SP-9000，北京中山金橋)逐項操作。IBA-1 陽性細胞呈棕黃色，切片選擇及細胞計數(shù)的方法同HE 染色，計算每只大鼠海馬CA1 區(qū)每個高倍鏡視野下的平均IBA-1陽性細胞數(shù)。

1.10 ELISA 測定海馬組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 的表達 向預存腦組織中加入PBS 冰浴充分勻漿，3 500 r/min 離心15 min 后取上清液采用ELISA 法(雙抗體夾心法)按照試劑盒說明書操作。先向待測樣品孔中加入待測樣品，洗滌后加一抗工作液，充分反應;洗滌后加酶標抗體工作液，充分反應;洗滌后加入底物工作液，充分反應后加入終止液，酶標儀450 nm 波長下讀取吸光度值(OD 值)，以標準品之OD 值繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線公式換算出腦組織中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 含量(ng/L)。

2 結果

2.1 Morris 水迷宮實驗檢測全腦缺血/再灌注后大鼠認知功能的變化 在定位測試中，與S 組相比，I/R 組大鼠找到平臺的時間顯著延長(P＜0.05)，表明缺血再灌注后動物認知功能明顯受損，模型建立成功;與I/R 組相比，I/R +RFP 組的尋臺平均潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，表明在全腦缺血后，及時給予利福平能夠改善大鼠受損的認知功能。見表1。

表1 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠逃避潛伏期的影響(±s，秒)Tab.1 Effect of rifampin on escape latency after GCIR(±s，s)

表1 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠逃避潛伏期的影響(±s，秒)Tab.1 Effect of rifampin on escape latency after GCIR(±s，s)

Note:1)P＜0.05 vs s group;2)P＜0.05 vs I/R group.

圖1 空間探索試驗典型軌跡圖Fig.1 Track of space exploration test

表2 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠跨臺次數(shù)的影響(±s)Tab.2 Effect of rifampin on crossings over platform after GCIR(±s)

表2 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠跨臺次數(shù)的影響(±s)Tab.2 Effect of rifampin on crossings over platform after GCIR(±s)

Note:1)P＜0.05 vs S group;2)P＜0.05 vs I/R group.

圖2 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 區(qū)病理形態(tài)學觀察(HE，×200)Fig.2 Hippocampus CA1 area pathological morphology in rats after I/R 7 days (HE，×200)

表3 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 神經(jīng)元細胞計數(shù)(±s)Tab.3 Count of hippocampus CA1 neurons in rats after I/R 7 days (±s)

表3 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 神經(jīng)元細胞計數(shù)(±s)Tab.3 Count of hippocampus CA1 neurons in rats after I/R 7 days (±s)

Note:1)P＜0.05 vs S group;2)P＜0.05 vs I/R group.

圖3 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 區(qū)IBA-1 免疫組化染色(SP，×200)Fig.3 Immunohistochemistry of IBA-1 in hippocampus CA1 in rats after I/R 7 days(SP，×200)

表4 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 區(qū)活化小膠質細胞計數(shù)(±s)Tab.4 Count of activation microglia in rats hippocampus CA1 after I/R 7 days (±s)

表4 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 區(qū)活化小膠質細胞計數(shù)(±s)Tab.4 Count of activation microglia in rats hippocampus CA1 after I/R 7 days (±s)

Note:1)P＜0.05 vs S group;2)P＜0.05 vs I/R group.

表5 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠海馬IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響(±s，ng/L)Tab.5 Effect of rifampin on expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in rats hippocampus after I/R(±s，ng/L)

表5 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠海馬IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響(±s，ng/L)Tab.5 Effect of rifampin on expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in rats hippocampus after I/R(±s，ng/L)

Note:1)P＜0.05 vs S group;2)P＜0.05 vs I/R group.

在記憶能力測試中，S 組及I/R+RFP 組跨臺次數(shù)明顯高于I/R 組(P＜0.05)，說明S 組及I/R +RFP 組中大鼠對原平臺位置的空間記憶優(yōu)于I/R組。I/R+RFP 組動物跨臺次數(shù)高于I/R 組(P＜0.05)，接近S 組(P＜0.05)，表明利福平能一定程度上改善缺血大鼠的認知功能。見圖1、表2。

2.2 HE 染色觀察全腦缺血/再灌注后海馬CA1 區(qū)病理學改變 S 組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元排列緊密，細胞呈圓形，結構清晰，核染色清晰，呈深藍色;I/R 組出現(xiàn)明顯核固縮，細胞結構不規(guī)則，排列松散，數(shù)目明顯減少(P＜0.05)。給予利福平后海馬神經(jīng)元損傷明顯減輕，較I/R 組有了明顯改善(P＜0.05)。見圖2、表3。

2.3 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠腦組織小膠質細胞活化的影響 S 組大鼠海馬CA1 區(qū)僅見零星少量IBA-1 陽性細胞，I/R 組CA1 區(qū)出現(xiàn)大量IBA-1陽性細胞(P＜0.05)。給予I/R 組大鼠利福平處理后海馬CA1 區(qū)IBA-1 陽性細胞明顯減少(P＜0.05)。見圖3、表4。

2.4 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響 與I/R 組比較，I/R+RFP 組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯下降(P＜0.05)，提示利福平能抑制大鼠全腦缺血再灌注損傷后海馬組織內IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達。見表5。

3 討論

大量研究表明利福平在神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病和帕金森氏病中具有神經(jīng)保護作用［9］。Kilic等［10］發(fā)現(xiàn)利福平能明顯增加MPP +作用后的多巴胺能神經(jīng)元的存活數(shù)量。而近年的研究進一步表明這可能與利福平減少ROS 的生成，抑制膠質細胞的活化，進而減輕神經(jīng)炎癥反應相關［1，11］。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)給予利福平處理后，全腦缺血再灌注大鼠空間學習記憶能力有明顯改善，海馬神經(jīng)元損傷減輕，活化膠質細胞數(shù)目及炎癥因子的表達受到一定程度的抑制。因此，利福平改善大鼠缺血后認知功能、抑制海馬神經(jīng)元損傷，其機制可能與抑制炎癥反應有關。

大鼠全腦缺血/再灌注模型模擬的是臨床上心臟驟停、休克、窒息等疾病發(fā)生的病理生理過程。大鼠在經(jīng)受全腦缺血再灌注后主要損傷的是對缺血敏感的海馬，最后導致學習記憶能力的減退［12］。在建立動物模型的過程中我們發(fā)現(xiàn)，抽取完預定量的血液后，雙側頸總動脈阻斷5 s 左右，動物的嘴唇及角膜變蒼白，雙側瞳孔逐漸散大、直接及間接對光反射消失，翻正反射消失。行為學實驗發(fā)現(xiàn)模型大鼠的空間記憶功能有明顯的損傷，同時海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元正常細胞數(shù)目明顯減少、細胞結構不規(guī)則，核固縮。此外模型組大鼠海馬CA1 區(qū)活化的小膠質細胞數(shù)目也顯著增多，海馬組織炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 的表達水平明顯升高。說明本實驗中我們所建立的大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型是成功的。

Morris 水迷宮實驗結果顯示，缺血再灌注組大鼠的平均逃避潛伏期較假手術組明顯延長，利福平干預組大鼠找到平臺的時間從第1 天起就低于缺血模型組，在第5 天找到平臺的時間與假手術組相比沒有明顯的差異。在空間探索試驗中，利福平干預組跨臺次數(shù)也遠多于模型組。表明利福平能夠促進缺血后大鼠認知功能障礙的恢復。

全腦缺血/再灌注導致的大鼠認知功能障礙的主要原因是海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)型壞死［13，14］，既往的研究證實缺血再灌后3 d 就可以看到大量CA1 區(qū)錐體細胞明顯破壞，海馬神經(jīng)元數(shù)目減少，形態(tài)不規(guī)則，細胞核固縮、乃至消失，胞漿嗜伊紅深染，且在再灌后7 d CA1 區(qū)遲發(fā)型死亡達到高峰［8，15］。而CA3 區(qū)對缺血有較好的耐受性，大部分細胞損害不明顯。因此本實驗采用再灌7 d 作為海馬神經(jīng)元檢測時間點，結果發(fā)現(xiàn)利福平干預組海馬CA1 區(qū)錐體細胞明顯增多，神經(jīng)元細胞核固縮、胞漿深染受到了一定程度的抑制，提示利福平對缺血后的海馬神經(jīng)元損傷有一定的保護作用。

全腦缺血后海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)型死亡與小膠質細胞的活化密切相關［16］。近年的研究提示利福平可以通過抑制脂多糖誘導的小膠質細胞的活化，從而提高神經(jīng)元的存活率。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)見大量小膠質細胞浸潤，利福平干預組小膠質細胞的活化明顯被抑制。此外，小膠質細胞活化后釋放的大量炎癥因子如IL-1β、IL-6 和TNF-α 可能是介導腦缺血后組織損傷的一個重要環(huán)節(jié)［17］。我們研究發(fā)現(xiàn)利福平處理后小膠質細胞的活化受到抑制的同時也伴隨著IL-1β、IL-6 和TNF-α 因子的釋放減少，因此這可能是利福平發(fā)揮腦缺血后保護作用的重要機制之一。

總之，本研究表明利福平對大鼠全腦缺血有明顯的保護作用，其機制可能與抑制小膠質細胞的活化，減少IL-1β、IL-6 和TNF-α 炎癥因子的釋放有關，因此可為利福平治療腦缺血提供一定的理論基礎。

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