劉雪婷 王 珊 張俊艷 劉兆宇 陳惠芳 鄒澤紅 肖蘭艷 及志恒 何 穎 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 廣東省過(guò)敏反應(yīng)與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室變態(tài)反應(yīng)研究室，廣州 510260)

甲型H7N9 流感病毒是在2013 年3 月在中國(guó)東部上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)的一種新型禽流感病毒［1］，感染該病毒將引起肺炎、呼吸道衰竭、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)［2］。截止到2014 年6 月11日，全國(guó)共報(bào)告感染H7N9 禽流感的患者共有434例，其中有165 人死亡，死亡率達(dá)38%。

甲型流感病毒顆粒外膜由兩型表面糖蛋白覆蓋，一型為血細(xì)胞凝集素(Hemagglutinin，HA)，一型為神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)。HA 蛋白的裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素。NA 蛋白在決定病毒毒力和宿主特異性方面也具有重要作用，與HA 共同成為流感病毒亞型分型的主要依據(jù)，NA 同時(shí)也是抗流感病毒的重要作用靶點(diǎn)［3］。甲型流感能不斷引起流行是由于其抗原性不斷發(fā)生漂移，使流感病毒逃過(guò)人體免疫系統(tǒng)的識(shí)別［4］，其中最重要是HA 和NA的變異［5］，因此可以通過(guò)針對(duì)HA 和NA 的表位疫苗技術(shù)來(lái)解決這一問(wèn)題。表位預(yù)測(cè)是表位疫苗設(shè)計(jì)的前提，本研究采用生物信息學(xué)方法，分析了H7N9流感病毒的28 種HA、24 種NA 的氨基酸序列的同源性，預(yù)測(cè)HA 和NA 蛋白的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞相關(guān)抗原表位，為新型H7N9 流感疫苗的制備提供依據(jù)。

人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)是位于人類(lèi)第6 號(hào)染色體短臂上的一組緊密連鎖的基因群，是目前已知人體中最具多態(tài)性的遺傳系統(tǒng)［6］。HLA 系統(tǒng)在不同民族種族和地區(qū)間分布不同，是機(jī)體對(duì)疾病易感的主要遺傳成分，即擁有不同的HLA 等位基因是導(dǎo)致個(gè)體間免疫應(yīng)答能力和對(duì)疾病易感性出現(xiàn)差異的主要遺傳學(xué)原因［6］。同時(shí)，HLA 是人體特異性免疫系統(tǒng)的一道重要屏障，HLA 分子提呈侵入人體的抗原呈遞給T 細(xì)胞，進(jìn)行抗原清除。HLA 和T 細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在介導(dǎo)病毒感染人體中發(fā)揮極其重要的作用［7］。本研究預(yù)測(cè)HLA-DRB1* 0701 等位基因與HA 和NA 有較強(qiáng)結(jié)合力，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)公布的該基因在不同地域人群中的基因頻率，推測(cè)對(duì)H7N9 病毒敏感的人群，以便更有效、及時(shí)地控制H7N9 流感的傳播。

1 材料與方法

1.1 HA 和NA 氨基酸序列的獲得及同源性分析從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)網(wǎng)站下載甲型H7N9 流感病毒的28 種HA 和24 種NA 的氨基酸序列，用ClustalX 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA4.0 的鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)序列比對(duì)分析結(jié)果，選取其中HA、NA 蛋白代表性的序列作為基準(zhǔn)序列，用于后續(xù)的B 細(xì)胞抗原表位、T 細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)以及對(duì)H7N9 易感人群的預(yù)測(cè)。

1.2 HA 和NA 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 應(yīng)用DNAStar 軟件中的Protean 模塊分析HA、NA 蛋白的基準(zhǔn)序列，根據(jù)Kyte-Doolittle 方案預(yù)測(cè)其親水性［8］;根據(jù)Karplus-Schulz 方案預(yù)測(cè)其柔韌性;根據(jù)Emini 方案預(yù)測(cè)其表面可及性［9］;根據(jù)Jameson-Wolf 方案預(yù)測(cè)其抗原性指數(shù)［10］，確定HA 和NA蛋白基準(zhǔn)序列的B 細(xì)胞抗原表位。選取親水性高、柔韌性好、表面可及性大、抗原性指數(shù)高的區(qū)域作為候選表位，并兼顧二級(jí)結(jié)構(gòu)各參數(shù)，避開(kāi)α-螺旋和β-折疊區(qū)域，確定HA、NA 蛋白的B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位。

1.3 HA 和NA 蛋白的T 細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 使用NetMHC Ⅱ2.2 Server 在線服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)分析26 種MHCⅡ類(lèi)分子(包括14 種HLA-DR、6 種HLA-DP 和6 種HLA-DQ 等位基因型)與H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的滑動(dòng)九肽的結(jié)合情況?；瑒?dòng)9 肽的選取方法為:第1～9 氨基酸序列對(duì)應(yīng)的肽段為第1 個(gè)九肽，第2～10 氨基酸序列對(duì)應(yīng)的肽段為第2 個(gè)九肽，第3～11 氨基酸對(duì)應(yīng)的肽段為第3 個(gè)九肽，以此類(lèi)推?；瑒?dòng)九肽與HLA 高親和力的閾值為0.64，低親和力的閾值為0.42。與26 種MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合力大于0.42 的九肽對(duì)應(yīng)的氨基酸序列視為是潛在的T抗原表位。

1.4 H7N9 流感病毒與HLA 等位基因相關(guān)性分析及易感人群預(yù)測(cè) 利用NetMHCⅡ2.2 Server 在線軟件分析HA、NA 蛋白的滑動(dòng)九肽與26 種HLA-Ⅱ類(lèi)分子的結(jié)合情況，篩選出與HA、NA 蛋白的滑動(dòng)九肽具有高親和力(親和指數(shù)大于0.64)的HLA-Ⅱ類(lèi)分子等位基因型，攜帶這些HLA 等位基因的人群可能是對(duì)H7N9 病毒存在高的免疫反應(yīng)性的易感人群。

從等位基因頻率數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.allele-frequencies.net/)查詢(xún)與HA、NA 蛋白具有高親和力的HLA 等位基因在亞洲不同國(guó)家的基因頻率，并通過(guò)文獻(xiàn)驗(yàn)證，根據(jù)HLA 等位基因頻率推測(cè)H7N9 流感病毒更有可能在哪些國(guó)家爆發(fā)。

2 結(jié)果

2.1 HA、NA 蛋白的氨基酸比較 經(jīng)過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，不同甲型H7N9 流感病毒株之間氨基酸序列相對(duì)保守，且28 種HA 以及24 種NA 氨基酸序列可以分為兩個(gè)大的族群(圖1A、B)。分別選取兩種蛋白的兩個(gè)族群中較有代表性的HA 氨基酸序列ABI84694.1 與AEK84761.1 和NA 氨基酸序列AFX85263.1 與AFU25736.1 為基準(zhǔn)序列以便進(jìn)行下一步的細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)。

圖1 H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的同源性分析Fig.1 Phylogenetic tree of HA and NA proteins in novel avian-origin influenza A (H7N9)virus

圖2 HA、NA 蛋白的B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of B cell epitopes on HA and NA proteins of novel avian-origin influenza A (H7N9)virus

2.2 HA、NA 蛋白的基準(zhǔn)序列的B 細(xì)胞抗原性預(yù)測(cè) 經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，HA 氨基酸序列ABI84694.1 與AEK84761.1 的B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果并沒(méi)有明顯差別，同 樣，NA 氨 基 酸 序 列 AFX85263.1 與AFU25736.1 的B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果也沒(méi)有明顯差別，因此只選取HA 氨基酸序列ABI84694.1 和NA 氨基酸序列AFX85263.1的結(jié)果列出。通過(guò)DNAStar軟件的Protean 模塊對(duì)HA 和NA 蛋白的親水性、柔韌性、表面可及性、抗原性指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。取親水性高、柔韌性好、表面可及性大、抗原性指數(shù)高的區(qū)域，綜合選取至少2 個(gè)上述參數(shù)較好的重疊區(qū)域，并兼顧二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，選取無(wú)規(guī)卷曲區(qū)域，獲得B細(xì)胞的抗原表位區(qū)域。從圖2A 綜合各參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在HA 蛋白中63-70、98-117、173-185、195-207、217-238、306-322、332-341、363-429、443-475、492-512 各項(xiàng)指數(shù)均較高，提示可能是抗原性表位;從圖2B 綜合各參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在NA 蛋白中1-9、57-60、97-105、137-141、143-150、162-168、210-215、219-222、258-263、273-280、310-323、415-425 各項(xiàng)指數(shù)均較高，提示為抗原性表位。

圖3 H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的T 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of T cell epitopes on HA and NA proteins of novel avian-origin influenza A (H7N9)virus

2.3 HA、NA 蛋白基準(zhǔn)序列的T 細(xì)胞抗原性預(yù)測(cè) 使用NetMHCⅡ2.2 Server 在線軟件預(yù)測(cè)了基準(zhǔn)株HA(ABI84694.1)、NA(AFX85263.1)蛋白的HA、NA 蛋白的滑動(dòng)九肽與26 種HLA-Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合力，結(jié)合力大于0.42 的滑動(dòng)九肽對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為T(mén) 抗原表位。軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，HA 蛋白中第13、24-29、87-89、116、133-183、202-204、225、241-268、290-303、317-324、338-341、377、401-438、510、527-546 滑動(dòng)九肽對(duì)應(yīng)的氨基酸區(qū)段與26 種HLA-Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合力較高(圖3A);NA 蛋白中第7、61-67、92、132-133、156、244-262、310、375-377、420-438 滑動(dòng)九肽對(duì)應(yīng)的氨基酸區(qū)域與26 種HLA-Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合力較高(圖3B)，可能為T(mén) 細(xì)胞抗原性表位。

2.4 H7N9 流感病毒與HLA 等位基因相關(guān)性分析及易感人群預(yù)測(cè) 根據(jù)NetMHCⅡ2.2 Server 在線軟件預(yù)測(cè)的HA、NA 蛋白的滑動(dòng)九肽與26 種HLA-Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合情況，我們篩選出與HA 蛋白的多個(gè)滑動(dòng)九肽具有高親和力的HLA 等位基因DRB1*0701、DQA1 * 0501-DQB1 * 0301、DPA1 * 0103-(DPB1* 0301/DPB1* 0401)(表1)以及與NA 蛋白的多個(gè)滑動(dòng)九肽具有高親和力的HLA 等位基因DRB1* 0701、DRB1* 0101(表2)，攜帶這些等位基因型的人群可能是H7N9 流感病毒的易感人群，尤其是DRB1* 0701 等位基因，與HA、NA 蛋白的多個(gè)滑動(dòng)九肽具有高親和力。

根據(jù)HLA 等位基因頻率數(shù)據(jù)庫(kù)的查詢(xún)結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)DRB1* 0701 在烏魯木齊維吾爾族人群基因頻率為16.7%，在哈爾濱滿族人群基因頻率為12.8%，在山東漢族人群基因頻率為11.2%，在遼寧漢族人群基因頻率為10.7%，在北京、石家莊、天津漢族人群基因頻率為9.5%，均屬于高頻率等位基因型，提示H7N9病毒在這些地區(qū)的危險(xiǎn)性較高;在中國(guó)廣東、云南、臺(tái)灣地區(qū)漢族人群基因頻率分別為5.7%、4.1%、2.8%;在日本、韓國(guó)人群中的基因頻率分別為6.7%、0.3%(表3)。

表1 HA 蛋白的滑動(dòng)九肽與HLA-Ⅱ等位基因的結(jié)合情況分析Tab.1 Analysis of affinity between peptides of HA protein and HLA-Ⅱalleles by NetMHCⅡ2.2 Server

表2 NA 蛋白的滑動(dòng)九肽與HLA-Ⅱ等位基因的結(jié)合情況分析Tab.2 Analysis of affinity between peptides of NA protein and HLA-Ⅱalleles by NetMHCⅡ2.2 .Server

表3 DRB1* 0701 在亞洲不同地區(qū)的頻率Tab.3 Frequency of DRB1* 0701 in different countries in Asia

3 討論

近年來(lái)隨著生物信息技術(shù)的快速發(fā)展，生物信息學(xué)軟件已成為預(yù)測(cè)抗原表位的有力工具。國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者都在生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上進(jìn)行抗原表位的研究。通過(guò)生物信息學(xué)軟件的預(yù)測(cè)可極大地提高表位篩選的成功率，減少實(shí)驗(yàn)工作量，節(jié)省研究時(shí)間。

理想的抗原表位最好能兼有B 細(xì)胞表位與T細(xì)胞表位的功能［28］。一方面可以通過(guò)刺激B 細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性抗體，直接與病毒結(jié)合。同時(shí)又可以與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合，遞呈到抗原遞呈細(xì)胞表面，引發(fā)T 細(xì)胞的活化，產(chǎn)生獲得性免疫應(yīng)答并能為B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體提供幫助。本研究利用軟件對(duì)H7N9 流感病毒的HA、NA 蛋白的基準(zhǔn)序列的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，HA 具有10 個(gè)B 細(xì)胞表位和15 個(gè)T 細(xì)胞表位;NA 有12 個(gè)B 細(xì)胞表位和9 個(gè)T 細(xì)胞表位，可以作為檢測(cè)以及疫苗研發(fā)的靶區(qū)域。但是細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)仍然不夠完善，目前幾乎所有的細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)的算法都是預(yù)測(cè)連續(xù)氨基酸組成的線性表位，而較少涉及構(gòu)象性表位的研究。本研究?jī)H是對(duì)新型H7N9 流感病毒的HA 和NA 蛋白的細(xì)胞抗原性表位進(jìn)行初步篩選，預(yù)測(cè)結(jié)果需要進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)證實(shí)。

HLA 的Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)基因在人類(lèi)基因組中多態(tài)性最為豐富，其產(chǎn)物主要具有提呈抗原、激活效應(yīng)T細(xì)胞的功能。它們本身多形異質(zhì)型以及參與免疫應(yīng)答，因此具有HLA-Ⅱ某些基因的人群對(duì)某些免疫疾病有易感性［29］。影響HLA 基因易感性的因素很多，包括種族的不同和地域的差異。本研究利用NetMHCⅡ2.2 Server 軟件分析與H7N9 流感病毒的HA、NA 蛋白具有高親和力的HLA 等位基因?yàn)镈RB1* 0701，并根據(jù)該基因在亞洲不同國(guó)家的基因頻率，預(yù)測(cè)H7N9 病毒可能的易感人群。

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