郭澤華 于世鵬 班 博 (山東大學，濟南 250100)

Graves 病(Graves' disease，GD)是甲狀腺功能亢進癥中最常見的一種，約占所有甲亢的85%，屬于自身免疫性疾病，具體發(fā)病機制尚未明確。目前大量研究表明免疫因素在其發(fā)病過程中起著關鍵作用，以Th2 細胞介導的體液免疫占主導地位［1］。而近年研究［2］發(fā)現一類不同于Th1、Th2 細胞的CD4+T 細胞的新分支Th17 細胞，主要分泌白介素(Interleukin，IL)-17 等相關細胞因子。IL-17 作為重要的炎性介質，可與IL-6、TNF-α、IFN-γ 等細胞因子發(fā)揮協同效應，放大靶器官免疫反應并增強炎癥性破壞作用［3］。Th17 細胞及其細胞因子參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生過程，影響自身免疫性抗體產生［4］。本實驗通過動態(tài)檢測GD 患者治療前后外周血中Th17 淋巴細胞比例及血清IL-17 水平，探討Th17 細胞在GD 中的變化及其意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象131I 治療組(131I therapy group):初診GD 患者31 例，男性9 例，女性22 例，年齡(36.42±9.95)歲，病程(4.87±5.1)月，均采用131I治療;甲巰咪唑(MMI)治療組(MMI therapy group):初診GD 患者30 例，男性8 例，女性22 例，年齡(36.10±9.67)歲，病程(5.14±3.2)月，采用甲巰咪唑治療。以上兩組年齡、性別、病程無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)。以上對象均按2007 年《中國甲狀腺疾病診治指南》［5］的Graves 病診斷標準進行篩選(浸潤性突眼除外)，并除外合并其他自身免疫性或炎癥性疾病、皮質類固醇或免疫抑制劑的使用者。正常對照組(Normal control group，NC group):選擇同期30 名性別、年齡相匹配且無新近感染、自身免疫疾病的家族史的健康體檢者。

1.2 試劑和儀器 異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人CD4 抗體、藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人IL-17A 抗體及其相匹配的同型對照均購自美國BD 公司;佛波酯(PMA)和Ionomyein 購自美國Enzo Life-Sciences 公司;莫能霉素、固定劑、破膜劑購自美國eBioscience 公司;RPMI1640 培養(yǎng)液及胎牛血清購自Hyclone 公司;IL-17 ELISA 試劑盒購自R＆D 公司;流式細胞儀為美國BD 公司FACS CantoTM型。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 甲巰咪唑治療方案:MMI 治療組結合患者的年齡、病情、病程、甲功三項結果均給予甲巰咪唑(50～100 g/8 h)口服治療，并根據其病程進展予適當加減治療劑量。131I 治療方案:131I 治療組均自愿選擇放射性131I 治療，131I 劑量(uCi)=甲狀腺重量(g)×每克甲狀腺組織131I 給予劑量(uCi/g)/24 h 攝碘率(%)［6］，結合患者的年齡、病情、病程等個體情況適當加減劑量，選擇4～5 mCi 放射性131I 劑一次性口服治療。研究分別在治療前(T0)、治療后1 個月(T1)、3 個月(T3)進行相關指標的測定。

1.3.2 標本收集和外周血單個核細胞的分離 所有對象均于清晨空腹時采集靜脈血8 ml，其中3 ml予2 500 r/min 離心5 min，取血清凍存于 -80℃，用于檢測IL-17 水平;另5 ml 采用人淋巴細胞分離液(Ficoll)密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞(PBMC)，用RPMI1640 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清0.1 mg/ml 鏈霉素和100 U/ml 青霉素)調整細胞濃度至2 ×106ml 個，用于流式細胞學檢測。所有標本均在4 h 內處理。

1.3.3 Th17 細胞檢測 ①淋巴細胞的刺激培養(yǎng):將調整好濃度的PBMC 懸液接種于24 孔培養(yǎng)板，加入PMA 25 ng/ml，Ionomyein 1.25 g/ml，莫能霉素1.7 g/ml，在37℃5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h;②細胞膜表面染色:收集細胞，加入20 μl CD4-FITC 單抗，室溫避光孵育30 min PBS 洗滌;③固定破膜:加入固定劑100 μl，室溫避光反應20 min，PBS洗滌，再加入破膜劑100 μl，室溫避光反應20 min，PBS 洗滌;④細胞內染色:將細胞平均分為測定管和對照管，測定管中加入IL17A-PE 20 μl，對照管中加入相應的同型對照抗體，混勻后4℃避光反應30 min，PBS 洗滌2 次。上流式細胞儀檢測，用CellsQuest 軟件獲取分析數據。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用±s 表示，兩組間比較根據方差是否齊性采用t 或t'檢驗;GD 治療前及治療后1 個月、3 個月Th17 細胞/CD4+T 細胞、血清IL-17 水平比較采用單因素重復測量的方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺指標比較 GD 患者治療前(T0 組)與正常對照組相比，T0 組游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)和促甲狀腺素受體抗體(TRAb)陽性率顯著高于正常對照組，促甲狀腺激素水平(TSH)明顯低于正常對照組(P ＜0.01)，131I 治療組與MMI 治療組相比(P ＞0.05)。見表1。

2.2 Th17 細胞、IL-17 治療前后比較131I 治療組、MMI 治療組治療前(T0)外周血Th17 細胞/CD4+T 細胞百分率及IL-17 水平，無明顯統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)，兩組均明顯高于正常對照組(P＜0.01)。治療前后(T0、T1、T3 組)之間比較采用單因素重復測量的方差分析:131I 治療組外周血Th17 細胞/CD4+T 細胞百分率及IL-17 水平在T0、T1、T3 組中水平逐漸下降(P ＜0.01)，F 值分別為131.350、326.206(P=0.000);MMI 治療組變化無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)。T3 組與NC 比較(P ＜0.01)，見圖1、表2。

2.3 相關性分析 采用Spearman 分析雙變量相關性:外周血Th17 細胞比例與血清IL-17 水平呈正相關(r=0.758，P ＜0.05);Th17 細胞比例、IL-17 水平與GD 患者血清甲狀腺相關抗體呈正相關。見表3。

表1 各組甲狀腺指標比較(±s)Tab.1 Thyroid hormones and autoantibodies of different groups(±s)

表1 各組甲狀腺指標比較(±s)Tab.1 Thyroid hormones and autoantibodies of different groups(±s)

Note:1)vs NC，P ＜0.01;2)131I therapy group vs MMI therapy group，P ＞0.05.

圖1 Th17 細胞流式細胞儀散點圖Fig.1 Typical dot plots of flow cytometric analysis of Th17 cells

表2 治療前后各組Th17 細胞、IL-17 的比較(±s)Tab.2 Comparison of mean values of Th17，IL-17 among T0，T1，T3 and NC group (±s)

表2 治療前后各組Th17 細胞、IL-17 的比較(±s)Tab.2 Comparison of mean values of Th17，IL-17 among T0，T1，T3 and NC group (±s)

Note:1)T0，T1，T3general linear model-repeated measures in 131I therapy group，P ＜0.01;2)T0，T3 vs NC t-test，P ＜0.01.

表3 Th17 細胞、IL-17 與甲狀腺相關抗體相關性Tab.3 Correlation between Th17 cells，IL-17 and thyroid autoantibodies

3 討論

Graves 病(GD)是由促甲狀腺激素受體刺激性抗體(TSAb)過度刺激甲狀腺組織，導致甲狀腺功能亢進和甲狀腺腫大的一種特異器官自身免疫性疾病［7，8］。其病因及發(fā)病機制復雜，既往認為Th1 細胞在GD 發(fā)病早期起主要作用，Th2 細胞在GD 晚期起作用［9］。隨著一種新型CD4+T 細胞——Th17細胞的發(fā)現和對其研究的深入，Th17 細胞及其相關細胞因子與GD 的關系受到關注，推測其可能參與GD 的發(fā)病，彌補了Th1/Th2 介導效應機制的不足。

3.1 Th17 細胞及其相關細胞因子IL-17 可能參與了GD 的發(fā)病 Th17 細胞是一種新型的CD4+效應細胞，具有獨立的分化和調節(jié)機制。Th17 細胞通過釋放細胞因子IL-17、IL-17F 和IL-22，吸引炎癥趨化因子和致炎因子聚集到正常細胞周圍［10］，IL-17可誘導前炎性細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶的表達，引起炎性細胞浸潤和組織損傷。且IL-17 可與其他致炎信號分子發(fā)生協同作用，增加致炎效應。

近年發(fā)現Th17 細胞及IL-17 在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要調節(jié)作用，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)［11］、銀屑?。?2］、類風濕關節(jié)炎［13］等。Nanba等［14］發(fā)現，GD 患者的Th17 細胞的比例明顯高于正常對照組，且難治性GD 組的Th17 細胞比例明顯高于GD 緩解組。而Kim［15］、Peng［16］等國內外相關研究結果顯示，Th17 細胞及IL-17 水平在GD 組中明顯升高。與以上研究結果一致，本實驗結果顯示131I 治療組、MMI 治療組GD 患者治療前(T0)外周血Th17 細胞/CD4+T 細胞百分率及IL-17 水平明顯高于正常對照組(P ＜0.01)。提示Th17 細胞可能在GD 發(fā)病中起重要作用。通過比較研究不同遺傳背景下NOD-H2 (h4)的鼠模型中，只有IL-17(+/ +)發(fā)生了Graves 病，Horie 等［17］進一步證明了Th17 細胞在GD 發(fā)病機制中起一定的作用。

3.2131I、MMI 治療GD 對Th17 細胞、IL-17 可能產生不同影響 臨床GD 治療方法為放射性131I 治療和口服藥物治療，常用口服藥物為甲巰咪唑和丙硫氧嘧啶，因丙硫氧嘧啶有較明顯副作用故對于一般GD 治療臨床多選用MMI。既往研究表明，131I、MMI對GD 患者具有一定的治療甲狀腺功能亢進作用之外的免疫調節(jié)作用，可調節(jié)細胞因子水平［18-20］。馬學芹［21］等對經131I 治療的初發(fā)GD 不同時間IL-17A、IL-17F 的測定，發(fā)現此二因子在131I 治療后水平下降，與治療前相比具有統(tǒng)計學意義。本實驗結果提示131I 治療組治療前后(T0、T1、T3)甲狀腺激素水平亦呈下降趨勢，且Th17 細胞/CD4+T 細胞百分率及IL-17 水平均明顯下降(P ＜0.01)，與Nanba、馬學芹等研究結果相符，表明131I 治療可通過影響Th17 細胞從而起到治療GD 的作用。目前對131I 治療對免疫系統(tǒng)影響的機制研究較少，尚未提出一定的概論，考慮Th17 細胞、IL-17 的水平下降一方面與131I 釋放β 射線破壞甲狀腺組織，使甲狀腺相關抗原耗竭，甲狀腺內活性T 淋巴細胞及相關細胞因子清除有關，另一方面甲狀腺功能紊亂的糾正可減少對免疫的損傷。Klatka 等［22］通過對比初發(fā)GD 組和經MMI 治療后病情緩解組患者外周血中Th17 細胞比例及絕對計數(P ＜0.05)，提示MMI 對GD 患者Th17 細胞有一定的調節(jié)作用。采用單因素重復測量的方差分析:本實驗MMI 治療組外周血Th17細胞/CD4+T 細胞百分率及IL-17 水平，在治療前后無明顯統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)，與Figueroa-Vega等［10］研究得出甲巰咪唑無法抑制Th17 細胞分泌細胞因子觀點一致。但和Klatka 等研究結果存在一定差異，可能與病人基因背景、病情嚴重程度、疾病階段不同等相關。以上結果顯示兩種治療方式對GD 的Th17 細胞、IL-17 可產生不同影響。國內外對131I、MMI 治療與免疫系統(tǒng)的關系研究仍較少，此方向尚待深入探討。

綜上所述，本研究通過比較兩種治療方案GD患者外周血中Th17 細胞、IL-17 的變化，反映出Th17 細胞及其相關因子可能參與了GD 的發(fā)病過程，并為放射性131I 可能對Th17 細胞及IL-17 產生一定作用提供了依據。但本研究存在樣本量較小等局限，對于Th17 細胞如何在GD 發(fā)病機制中起作用，以及兩種治療方法是否可直接調節(jié)免疫系統(tǒng)治療GD，仍需進一步研究。

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