宋艷華，張 燕，胡 波，范志宇，魏后軍，劉 星，黃 兵，薛家賓，徐為中，王 芳*

(1．江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014;

2．山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東濟(jì)南250023)

兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種具有高度傳染性、高發(fā)病率、高致死性的疾病，是兔的一種毀滅性傳染病［1-2］。該病在世界各地都有發(fā)生，在歐洲和東亞地區(qū)呈地方性流行［3-5］。兔出血癥的病原RHDV是杯狀病毒的成員之一，屬于單鏈正股RNA病毒，基因組長約7．5 kb，其衣殼蛋白VP60可自行裝配形成VLPs(Virus-like particles)［6-9］，是 RHDV 結(jié)構(gòu)及免疫原性研究的重點(diǎn)［10-13］。目前，已有大量研究表明VP60 VLPs可以作為外源表位遞呈載體和基因轉(zhuǎn)移載體，為其發(fā)展成為攜帶多表位的載體疫苗提供依據(jù)［14-18］。

為進(jìn)一步擴(kuò)展RHDV VLPs作為載體容納外源片段的長度以及作為載體有效遞呈外源T細(xì)胞表位的能力，筆者將外源雙串聯(lián)CD8+T細(xì)胞表位，序列為GSSIINFEKLGSSIINFEKLGS，按照以下方式分別整合到VP60序列中:將雙串聯(lián)OVA CD8+T細(xì)胞表位插入VP60 N末端;將雙串聯(lián)OVA CD8+T細(xì)胞表位序列分別替換VP60蛋白的2～13AA和302～309AA，通過桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建嵌合體，最終表達(dá)獲得3種嵌合蛋白，分別命名為 VP60-DN1、VP60-DN2 和 VP60-DC［19-20］。在上述研究的基礎(chǔ)上，筆者將獲得嵌合蛋白進(jìn)行濃縮純化，選擇特異性的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫試驗(yàn)，通過體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答全面闡述VP60作為載體遞呈外源表位的能力，進(jìn)一步證實(shí)VP60 VLPs具有作為疫苗載體的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1．1 試劑、病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60、rAcV-Bac-DN1、rAcV-Bac-DN2 和 rAcV-Bac-DC 由農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存［2，19-20］。OVA CD8+T細(xì)胞表位多肽由吉爾生化公司合成;ELISPOT試劑盒購自Mabtech公司。7～8周齡C57BL/6雌性小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1．2 病毒樣顆粒的電鏡觀察 將重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60、rAcV-Bac-DN1、rAcV-Bac-DN2 和 rAcV-Bac-DC 接 種Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)4～5 d待細(xì)胞完全病變后，分別收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBS重懸洗滌3次后，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清，用作電鏡觀察。將待檢病毒培養(yǎng)物樣品滴于載樣銅網(wǎng)上，吸附作用2 min，將2%的磷鎢酸染液滴于銅網(wǎng)上，固定2 min。室溫干燥后用H-7650型透射電鏡對(duì)嵌合蛋白進(jìn)行觀察。

1．3 嵌合蛋白的制備 將4種重組桿狀病毒分別以1%體積比接種于單層Sf9昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)4～5 d待細(xì)胞完全病變后，分別收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后，5 000 g離心15 min去除細(xì)胞碎片，再次10 000 g離心30 min去除大的蛋白復(fù)合物和桿狀病毒粒子，上清中的VLPs再次100 000 g離心2．5 h進(jìn)行濃縮，4℃PBS重懸沉淀，進(jìn)一步通過蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化，將樣品鋪于10% ～50%蔗糖上，100 000 g 4℃離心2 h，吸取分界面的樣品，再次超速離心100 000 g 4℃離心2 h除去蔗糖，沉淀用PBS重懸。利用BAC蛋白定量試劑盒測(cè)定純化后重組蛋白的濃度，最終獲得的重組蛋白分別命名為DN1、DN2、DC和VP60蛋白。

1．4 嵌合蛋白的免疫特性研究

1．4．1 動(dòng)物免疫。將嵌合蛋白DN1、DN2、DC以及VP60蛋白分別免疫7～8周齡C57BL/6雌性小鼠，每組5只，共免3次，每次間隔2周，免疫程序見表1。設(shè)置相同注射體積的PBS組作為空白對(duì)照組。于首免后0、4和6周對(duì)所有小鼠尾部采血分離血清，采用建立的間接ELISA方法［21］檢測(cè)VP60特異性抗體滴度。于首免后6周將所有小鼠安樂死后分離脾淋巴細(xì)胞，用于檢測(cè)特異性IFN-γ分泌水平。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)免疫程序

1．4．2 VP60特異性抗體效價(jià)的測(cè)定。首免后0、4和6周對(duì)所有小鼠尾部采血分離血清，采用間接ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中抗VP60的特異性抗體滴度。用pH 9．6包被液稀釋VP60蛋白，4℃下包被過夜。脫脂乳37℃下封閉2 h。洗滌后每孔加入倍比稀釋的待檢血清，100μl/孔，37℃孵育1 h。加入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h。加入顯色液100μl/孔，避光作用10 min，最后加入終止液，50μl/孔。自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值，將P/N≥2．1即判定為陽性，計(jì)算抗體滴度。

1．4．3 ELISPOT檢測(cè)特異性IFN-γ分泌水平。首免后6周，將各免疫組小鼠處死取脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度為2．5×106個(gè)/ml。每組小鼠的脾淋巴細(xì)胞作3個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)置非特異性刺激物ConA為陽性對(duì)照。ELISPOT檢測(cè)步驟為:用50μl/孔70%乙醇預(yù)處理ELISPOT板;棄去液體，無菌水洗滌5次;用無菌PBS(pH 7．4)稀釋包被IFN-γ 抗體(AN18)至15 μg/ml，每孔100μl，4℃包被過夜;棄去包被液，并用無菌PBS洗板5次;加入含10%胎牛血清RPMI-1640 200μl/孔，室溫孵育30 min。棄去細(xì)胞上清，加入含有2．5μg/ml OVA T細(xì)胞表位多肽刺激物的脾淋巴細(xì)胞懸液，200μl/孔。用錫箔紙包住板子置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，孵育48 h。48 h后棄去細(xì)胞液，PBS洗板5次;用0．5%FBS-PBS稀釋檢測(cè)抗體(R4-6A2-生物素)至1 μg/ml，100 μl/孔，室溫作用2 h。PBS 洗板5 次，用0．5%FBS –PBS1∶1 000 稀釋聯(lián)合親霉素-ALP，100 μl/孔，室溫作用1 h。PBS洗板5次，底物(BCIP/NBT-plus)用0．45μm的濾器進(jìn)行過濾，100μl/孔，室溫作用直至出現(xiàn)斑點(diǎn)。用水沖洗即可終止顯色反應(yīng)，將板子倒置晾干，室溫避光保存板子。利用ELISpot reader觀察并計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2．1 嵌合蛋白的鑒定 電鏡結(jié)果表明，3種嵌合蛋白DN1、DN2和DC均可形成大小約為40 nm的VLPs，形態(tài)大小均與VP60蛋白VLPs相似(圖1)，說明VP60的2～13AA和302～309AA區(qū)域的改造不影響VP60 VLPs的形成。

2．2 VP60特異性抗體效價(jià)的測(cè)定 為檢測(cè)嵌合VP60蛋白免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)，分別于首免后0、4和6周采血分離血清，采用ELISA檢測(cè)各組誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)滴度。從圖2可以看出，嵌合蛋白組以及VP60組誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)滴度與PBS對(duì)照組差異極顯著(P＜0．001)。DN1、DN2、DC 和 VP60組免疫后與免疫前抗體效價(jià)差異極顯著(P＜0．001)，首免后6周，嵌合蛋白組與VP60組抗體效價(jià)均高于首免后4周的水平，且消長規(guī)律一致。嵌合蛋白組與VP60組之間抗體效價(jià)并無顯著性差異(P＞0．05)。這表明，重組蛋白免疫后能有高效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗VP60特異性抗體，且外源雙串聯(lián)T細(xì)胞表位的插入并未影響抗體產(chǎn)生的水平，嵌合蛋白有效地保持了VP60蛋白原有的免疫特性。

2．3 ELISPOT檢測(cè)特異性IFN-γ分泌水平 為了檢測(cè)嵌合蛋白中插入的雙串聯(lián)OVA T細(xì)胞表位能否誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，首免后6周分離免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞，利用合成OVAT細(xì)胞表位多肽刺激淋巴細(xì)胞，ELISPOT檢測(cè)各免疫組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌特異性IFN-γ的水平。從圖3可以看出，VP60組無斑點(diǎn)產(chǎn)生，而3種嵌合蛋白組均顯示出一定數(shù)量的斑點(diǎn)，說明能夠誘導(dǎo)特異性IFN-γ的分泌，同時(shí)非特異性刺激劑ConA作為陽性對(duì)照，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-γ的分泌。

將所有細(xì)胞孔中的斑點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。從圖4可以看出，3種嵌合蛋白免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞均能夠分泌特異性IFN-γ，且分泌水平顯著高于 VP60及 PBS對(duì)照組(P＜0．001)，其中DN1和DN2組分泌特異性IFN-γ的水平顯著高于DC組(P＜0．05)。該結(jié)果表明在VP60 N端插入外源T細(xì)胞表位與VP60 302～309AA相比，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答更加強(qiáng)烈。

3 討論

在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)RHDV VP60蛋白時(shí)，它能夠自發(fā)地形成形態(tài)學(xué)上和抗原學(xué)上與天然病毒無差異的病毒樣顆粒，其可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體及有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，不含有遺傳物質(zhì)，能夠攜帶和有效遞呈外源片段，可以作為疫苗載體，為新型疫苗的研制提供基礎(chǔ)。Nagesha等［17］研究了對(duì)RHDV VP60的N-端和C-端進(jìn)行缺失處理或用藍(lán)舌病毒衣殼蛋白VP7上的一個(gè)特征性的6個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)—Btag進(jìn)行替換，結(jié)果表明在N-端插入外源序列不影響嵌合蛋白形成VLPs。E．Crisci［14］等在 VP60 的 N 端和 306AA 中插入單個(gè)OVA CD8+T細(xì)胞表位，結(jié)果顯示可形成嵌合的RHDV樣的病毒粒子，且可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答。Khairunadwa Jemon等［22］將人通用輔助性T細(xì)胞表位PADRE插入VP60蛋白的N末端，并在形成的VLPs表面連接人乳頭瘤病毒E6蛋白中一小肽，該嵌合VLPs能夠?qū)δ[瘤小鼠的產(chǎn)生有效的免疫治療，并延長腫瘤小鼠的存活時(shí)間，研究表明VP60 N末端是一個(gè)良好的外源T細(xì)胞表位插入位點(diǎn)。在以上研究報(bào)道的基礎(chǔ)上，筆者選擇N端插入或替換為雙串聯(lián)OVA CD8

+T細(xì)胞表位的方式構(gòu)建并獲得2種嵌合蛋白，且將302～309AA替換為串聯(lián)OVA CD8+T細(xì)胞表位構(gòu)建并獲得一種嵌合蛋白，嵌合蛋白共攜帶外源片段的長度為22個(gè)氨基酸，通過嵌合蛋白的純化鑒定、動(dòng)物免疫以及免疫后體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嵌合蛋白仍然具有形成VLPs的能力，且能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，該試驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致，且進(jìn)一步擴(kuò)展了RHDV VP60作為載體容納外源片段的長度，驗(yàn)證了VLPs具有高效遞呈外源T細(xì)胞表位的能力。

Xue Wang等通過低溫電鏡和晶體學(xué)技術(shù)解析RHDV的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)VP60的300～318位氨基酸含有位于病毒粒子最外表面的Loop區(qū)［13］。該研究中選取的替換位點(diǎn)302～309AA包含在300～318位氨基酸中，位于P2亞單位突環(huán)處，且不包含保守氨基酸位點(diǎn)，故可能對(duì)外源基因的耐受性較高。該研究結(jié)果表明在VP60的N端和302～309位插入長達(dá)66 bp的外源片段后不影響VP60的自我組裝。

ELISPOT技術(shù)是一種國際公認(rèn)的用于檢測(cè)特異性效應(yīng)細(xì)胞分泌水平的方法。為檢測(cè)VP60作為展示系統(tǒng)遞呈外源OVA T細(xì)胞表位的能力，筆者在首免后6周分離脾淋巴細(xì)胞，利用ELISPOT方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，嵌合蛋白組均能誘導(dǎo)分泌特異性IFN-γ。該研究中VP60 N端插入外源T細(xì)胞表位的嵌合蛋白組比在VP60 302-309位插入外源表位的嵌合蛋白組引起的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答能力更強(qiáng)，此結(jié)果與E．Crisci等的報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了N末端能夠更加有效的遞呈外源T細(xì)胞表位。

筆者利用前期構(gòu)建的3種嵌合蛋白DN1、DN2和DC，進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，通過體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)嵌合蛋白的免疫特性，結(jié)果表明3種嵌合蛋白均能引起針對(duì)載體VP60的特異性抗體應(yīng)答;且能夠誘導(dǎo)特異性IFN-γ的分泌，其中DN1和DN2誘導(dǎo)的分泌水平高于DC組。這說明在VP60 N端插入外源T細(xì)胞表位比在VP60 302～309位插入表位引起的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答能力更強(qiáng)。該研究結(jié)果擴(kuò)展了VP60-VLPs作為載體容納外源片段的長度，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證了VP60-VLPs遞呈外源表位的載體效應(yīng)。

［1］蔡寶祥．家畜傳染病學(xué)［M］．3版．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998:299-301．

［2］王芳，胡波，范志宇，等．兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)家兔的免疫保護(hù)效果［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39(10):1382-1387．

［3］LIU SJ，XUEH P，PUB Q，et al．A new viral disease in rabbit［J］．Anim-Husb Vet Med，1984，16:253-255．

［4］XUWY．Viral haemorrhagic diseaseof rabbitsin the People’s Republic of China:Epidemiology and virus characterization ［J］．Rev Sci Tech，1991，10:393-408．

［5］PARK NY，CHONGCY，KIM JH，et al．An outbreak of viral haemorrhagic pneumonia(tentative name)of rabbits in Korea［J］．JKorean Vet Med Assoc，1987，23:603-610．

［6］BOGA JA，MARTíN ALONSOJM，Casais R，et al．A single dose immunization with Rabbit haemorrhagic disease virus major capsid protein produced in Saccharomyces cerevisiae induces protection ［J］．J Gen Virol，1997，78:2315-2318．

［7］LAURENT S，VAUTHEROT J F，MADELAINE M F，et al．Recombinant Rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus self-assembles into viruslike particles and induces protection［J］．JVirol，1994，68(10):6794-6798．

［8］NAGESHA H S，WANG L F，HYATT A D，et al．Self-assembly，antigenicity，and immunogenicity of the Rabbit haemorrhagic disease virus(Czechoslovakian strain V-351)capsid protein expressed in baculovirus［J］．Arch Virol，1995，140(6):1095-1108．

［9］SIBILIA M，BONIOTTI M B，ANGOSCINI P，et al．Two independent pathways of expression lead to self-assembly of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein ［J］．JVirol，1995，69(9):5812-5815．

［10］LIZ X，HUWD，LIB C，et al．Egg yolk IgY against RHDVcapsid protein VP60 promotes rabbit defense against RHDV infection［J］．Vet Immunol Immunopathol，2014，157(1/2):97-104．

［11］GAOJ，MENGC，CHENZ，et al．Codon optimization of the rabbit hemorrhagic disease virus(RHDV)capsid gene leads to increased gene expression in Spodopterafrugiperda9(Sf9)cells［J］．JVet Sci，2013，14(4):441-447．

［12］YUAND，QUL，LIUJ，et al．DNAvaccination with ageneencoding VP60 elicited protective immunity against rabbit hemorrhagic disease virus［J］．Vet Microbiol，2013，164(1/2):1-8．

［13］WANG X，XU F，LIU J，et al．Atomic model of rabbit hemorrhagic disease virus by cryo-electron microscopy and crystallography［J］．PLoS Pathog，2013，9(1):1003132．

［14］CRISCI E，ALMANZA H，MENA I，et al．Chimeric calicivirus-like particles elicit protective anti-viral cytotoxic responses without adjuvant［J］．Virology，2009，387:303-312．

［15］LAURENT S，KUT E，REMY-DELAUNAY S，et al．Folding of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein and delineation of N-terminal domains dispensable for assembly ［J］．Arch Virol，2002，147:1559-1571．

［16］BARCENA J，MORALESM，VAZQUEZ B，et al．Horizontal transmissible protection against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease by using a recombinant myxoma virus［J］．JVirol，2000，74:1114-1123．

［17］NAGESHA H S，WANGL F，HYATT A D．Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers［J］．Arch Virol，1999，144:2429-2439．

［18］BARCENA J，VERDAGUERN，ROCA R，et al．The coat protein of Rabbit hemorrhagic disease virus contains a molecular switch at the N-terminal region facing the inner surface of the capsid［J］．Virology，2004，322:118-134．

［19］張燕，王芳，胡波，等．兔出血癥病毒衣殼蛋白N端攜帶雙串聯(lián)卵清蛋白T細(xì)胞表位嵌合體的構(gòu)建與表達(dá)［J］．畜牧與獸醫(yī)，2014，46(6):1-8．

［20］張燕，胡波，宋艷華，等．?dāng)y帶雙串聯(lián)卵清蛋白T細(xì)胞表位的嵌合兔出血癥病毒衣殼蛋白自聚能力的研究［J］．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29(1):55-61．

［21］李超美，王芳，蔡少平，等．檢測(cè)兔出血癥病毒抗體間接ELISA方法的建立［J］．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26(5):546-550．

［22］JEMONK，YOUNGV，WILSONM，et al．An enhanced heterologous viruslike particle for human papillomavirus type 16 tumour immunotherapy［J］．PLoSOne，2013，8(6):66866．