黃巧娟，孫志高*，龍 勇，孫 謙

（西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712）

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D-檸檬烯抗癌機(jī)制的研究進(jìn)展

黃巧娟，孫志高*，龍 勇，孫 謙

（西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712）

摘 要：D-檸檬烯是一種天然的單萜烯，廣泛存在于柑橘、蔬菜及香料中，具有消炎、抑菌、抗腫瘤等多種功效。其中抗癌是D-檸檬烯的主要藥理活性之一，其抗癌機(jī)制主要包括化學(xué)預(yù)防作用、抑制細(xì)胞周期與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲等。由于D-檸檬烯具有來源廣泛、安全性好、給藥方便等優(yōu)點，具有良好的開發(fā)前景和臨床應(yīng)用價值，亟待深入研究。

關(guān)鍵詞：D-檸檬烯；癌癥；抗癌機(jī)制；細(xì)胞凋亡

D-檸檬烯（D-limonene）又稱D-苧烯，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，是柑橘精油的主要成分，具有消炎、減痛、抑菌、預(yù)防和治療癌癥的作用[1-2]，可作為增香劑、抗氧化劑等添加到食品中[3]。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯還可作為空氣清潔劑、綠色提取劑和抗蟲劑的主要成分，并已取得階段性成果[4-6]。D-檸檬烯已被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)藥、化工和醫(yī)藥等多個行業(yè)和領(lǐng)域中，其在癌癥防治中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注和重視。

圖 11 D-檸檬烯化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of D-limonene

早在20世紀(jì)70年代，人們就發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯具有抗腫瘤活性。1971年Homburger等[7]給小鼠注射D-檸檬烯或橙油時，發(fā)現(xiàn)它們能明顯降低苯并（rst）戊芬致癌物所誘發(fā)的腫瘤發(fā)生率。從此，人們對D-檸檬烯的抗癌活性進(jìn)行了廣泛的研究，并發(fā)現(xiàn)其抗癌功效具有廣譜性[8]，對乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等均具有抑制作用（詳見表1），并能減輕各種癌癥帶來的損傷[9]。

綜合分析已報道的文獻(xiàn)，D-檸檬烯抗癌機(jī)制主要有化學(xué)預(yù)防作用、抑制細(xì)胞周期與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、以及抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等，分別介紹如下。

1　化學(xué)預(yù)防作用

D-檸檬烯對化學(xué)因子引起的嚙齒類動物乳腺癌、淋巴癌、肺癌、胃癌、皮膚癌、肝癌以及致癌因子H-Ras突變誘發(fā)的大鼠乳腺腫瘤均具有化學(xué)預(yù)防作用[20,29-30]，其化學(xué)預(yù)防作用主要包括：抗氧化、抗炎癥及免疫調(diào)節(jié)等[26]。

表 11 D-檸檬烯對不同癌癥的影響Table 1 Effect of D-limonene on different cancerss

1.1抗氧化

自由基造成的氧化損傷對癌癥的產(chǎn)生及發(fā)展有著重要作用，抵抗氧化損傷能很好的預(yù)防癌癥[31]，而富含D-檸檬烯的精油提取物是一種良好的抗氧化劑[32]。Jayaprakasha等[33]發(fā)現(xiàn)，富含D-檸檬烯的金橘精油具有良好的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、抗氧化能力和抗炎活性，使機(jī)體免受氧化損傷。

1.2抗炎癥

炎癥反應(yīng)與癌癥具有密切的關(guān)系，核轉(zhuǎn)錄因子-κB （nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB）是聯(lián)系炎癥反應(yīng)與癌癥的中介分子之一[34]。促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）在癌癥的啟動及發(fā)展階段起著重要作用[35]。通過抑制NF-κB活性干擾TNF-α或IL-6信號傳遞，能使癌癥的發(fā)生、發(fā)展得到很好的控制[36]。D-檸檬烯能抑制NF-κB信號通路[37]，從而預(yù)防炎癥及癌癥的發(fā)生。Kummer等[38]研究柑橘精油及檸檬烯對BALB/c小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用酵母聚糖誘導(dǎo)小鼠腹膜炎時，小鼠腹膜細(xì)胞會產(chǎn)生TNF-α及IL-6，而用柑橘精油及檸檬烯對小鼠進(jìn)行前處理的實驗組TNF-α及IL-6的表達(dá)受到抑制。Chi Gefu等[39]研究也表明D-檸檬烯能抑制NF-κB的活性，從而抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

1.3免疫調(diào)節(jié)

D-檸檬烯對免疫系統(tǒng)的影響尚存爭議。有研究者[40]認(rèn)為檸檬烯能增強(qiáng)免疫應(yīng)答，促使免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗體，新發(fā)展的細(xì)胞免疫療法即為通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力來抑制或消除腫瘤的新型生物技術(shù)，現(xiàn)已廣泛用于多種癌癥的治療[41]。Toro-Arreola等[18]認(rèn)為D-檸檬烯主要通過調(diào)控2,4-二硝基氟代苯（2,4-dinitro-1-fluorobenzene，DNFB）的超敏反應(yīng)、巨噬細(xì)胞的吞噬作用，以及滅菌活性等來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，而不影響T細(xì)胞的活性。

而另一些研究者則認(rèn)為D-檸檬烯及其代謝物具有免疫抑制作用，Lappas等[42]研究發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯能抑制CD3＋、CD4＋、CD8＋等T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞干擾素-γ （interferon-γ，IFN-γ）、IL-2、TNF-α、IL-4和IL-13，并能調(diào)控CD25、CD69和CD40L等T淋巴細(xì)胞的活性，即D-檸檬烯通過影響T細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。此外，Imamura等[43]發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯的代謝物紫蘇醇也具有免疫抑制作用，能抑制CD4＋細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞活素物質(zhì)。

2　抑制細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2.1調(diào)控癌基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)

體內(nèi)的致癌基因和抑癌基因調(diào)控著癌細(xì)胞的生長與凋亡，抑制致癌基因的表達(dá)及活化抑癌基因能有效抵抗癌癥的發(fā)生。常見的致癌基因有Bcl-2、c-myc、Ras、c-jun，抑癌基因有Bax、Cx32、Cx43、p53[44]。

Ras基因介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞，對于細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、惡性轉(zhuǎn)移起著重要作用，Ras蛋白必須進(jìn)行異戊二烯化修飾，并定位在細(xì)胞膜上才具有激活下游信號的能力[45]。目前發(fā)現(xiàn)修飾Ras蛋白的聚異戊二烯基團(tuán)主要有法尼基及二牛龍牛兒基。臨床實驗表明，D-檸檬烯抑制Ras蛋白異戊二烯化修飾主要通過抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶（FTase）的活性[46]，或抑制甲羥戊酸衍生的異戊二烯復(fù)合物與Ras蛋白或Ras相關(guān)蛋白的結(jié)合[47]而實現(xiàn)，從而使Ras蛋白無法附于細(xì)胞膜上而失去活性。D-檸檬烯作為一種新型的天然法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑逐漸成為抗癌研究的熱點。

細(xì)胞周期素D（cyclinD）是一種原癌基因，共有CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3這3 個家族。CyclinD1通過促進(jìn)G1期向S期的轉(zhuǎn)變而促進(jìn)細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)組織細(xì)胞增殖，并與個體發(fā)育及腫瘤形成等有關(guān)[48]。Miller等[49]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)：每天服用2 g檸檬烯并持續(xù)2～6 周，乳腺癌腫瘤組織中Cyclin D1表達(dá)減少了22%（P=0.002），且細(xì)胞周期停滯于G1/S期，從而抑制細(xì)胞增殖。

Bax/Bcl-2與p53在促進(jìn)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。D-檸檬烯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡常與Bax、Bcl-2及p53有關(guān)，Bax/Bcl-2升高有利于細(xì)胞凋亡，而p53基因能促使細(xì)胞停滯于G0/G1期。Jayaprakasha等[33]在D-檸檬烯抗癌機(jī)制的體外實驗研究中發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯能抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP的增殖，當(dāng)精油的質(zhì)量濃度為200 mg/L時，在24、48、72 h時其抑制率分別為55%、61%、63.4%，且Bax/Bcl-2升高，p53蛋白的表達(dá)增加。此外，D-檸檬烯還能有效抑制致癌因素如c-jun和c-myc在癌細(xì)胞中的過度表達(dá)[12,50]，從而抑制癌癥發(fā)生。

2.2阻斷細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase（PI3K）/protein kinase B（Akt））通路通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，與多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[51]。線粒體通路是細(xì)胞凋亡的主要通路之一，其中Bcl-2家族基因的變化調(diào)控著線粒體外膜的通透性，控制細(xì)胞色素c的釋放。細(xì)胞色素c刺激Caspase-9進(jìn)而活化Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。D-檸檬烯作用于癌細(xì)胞常抑制PI3K/Akt通路或促進(jìn)線粒體通路，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22,25]。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯能抑制磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）的表達(dá)，從而切斷絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或通過調(diào)節(jié)Ras-ERK途徑來抑制癌癥[20,24]。細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路對癌癥的影響重大，當(dāng)前仍需深入、系統(tǒng)地研究D-檸檬烯對各種信號傳導(dǎo)通路的作用，進(jìn)一步探明其機(jī)制。

3　抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移

3.1抑制腫瘤新生血管的生成

腫瘤血管生成是原發(fā)腫瘤持續(xù)增殖和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的首要條件，惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程依賴于新生血管為其提供足夠的脈管系統(tǒng)，而新血管的生成依賴于血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的調(diào)節(jié)。有研究證明D-檸檬烯及其代謝產(chǎn)物紫蘇酸和紫蘇醇均具有抑制腫瘤新生血管的作用，但關(guān)于其對腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)和腫瘤新生血管的生成作用及機(jī)制的研究較少[6,52]。

3.2抑制轉(zhuǎn)移蛋白Fascin-1和COX-2的表達(dá)

Fascin-1是一種重要的胞質(zhì)蛋白，它決定著細(xì)胞微絲骨架的分布和活動，可能在細(xì)胞遷移、侵襲以及細(xì)胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用[53]。研究表明D-檸檬烯通過下調(diào)Fascin-1蛋白表達(dá)，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制體外侵襲[28]。環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是一種膜結(jié)合蛋白，在炎癥和腫瘤中起重要作用。COX-2主要通過促進(jìn)腫瘤血管生成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、抑制免疫功能及抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制而導(dǎo)致或促進(jìn)癌癥的發(fā)展[54]。Chaudhary等[20]發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯能抑制COX-2的表達(dá)，降低鳥氨酸脫羧酶的活性，阻止胸腺嘧啶摻入DNA中，從而起到抑制癌癥的效果。

4　結(jié) 語

D-檸檬烯抗癌機(jī)制的研究已有一段時間，但由于D-檸檬烯的抗癌效應(yīng)常是幾種機(jī)制的綜合作用，具有復(fù)雜性，現(xiàn)仍未被人們完全明確和系統(tǒng)了解。比如D-檸檬烯對免疫調(diào)節(jié)的抗癌機(jī)制仍存在爭議。在光照下和空氣中，D-檸檬烯會分解成小分子氧化物進(jìn)而影響其安全性等，將D-檸檬烯應(yīng)用到臨床治療還有待進(jìn)一步研究。針對D-檸檬烯研究存在的上述缺陷或不足，結(jié)合當(dāng)前的新型制備和研究技術(shù)，對D-檸檬烯的深度利用提出以下幾點展望。

4.1安全性研究

D-檸檬烯作為天然植物提取物，其抗癌機(jī)理已成為當(dāng)今研究的熱點問題。經(jīng)體內(nèi)外及臨床實驗證明，相對于傳統(tǒng)的抗癌藥物，D-檸檬烯具有綠色、安全、高效等優(yōu)點[53,55]，并被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）定義為一般公認(rèn)安全級（generally recognized as safe，GRAS）添加劑[56]，被美國食用香料與提取物制造商協(xié)會（Flavor and Extract Manufactures Association of the Unite States，F(xiàn)EMA）批準(zhǔn)食用[57]。然而，有研究表明在暴露的條件下，D-檸檬烯通過調(diào)節(jié)雄性小鼠體內(nèi)α2u-球蛋白的表達(dá)發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[8]。而最近Mauro等[58]在倉鼠細(xì)胞V79中對暴露的D-檸檬烯進(jìn)行安全性實驗，發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯對細(xì)胞的毒性作用并不是因為影響α2u-球蛋白的表達(dá)發(fā)生的，而是通過影響細(xì)胞分裂中紡錘體的形成及破壞染色體而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這也就否定了暴露的D-檸檬烯只對雄性小鼠發(fā)揮作用的說法。他們認(rèn)為，暴露的D-檸檬烯造成染色體破損可能是由于細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累導(dǎo)致的細(xì)胞毒性作用。曾有研究者發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯能促使癌細(xì)胞中ROS的增加，但對正常細(xì)胞沒有影響[33]，D-檸檬烯是否會造成正常細(xì)胞ROS的積累及其發(fā)生條件需進(jìn)行更多的實驗進(jìn)行驗證。

4.2與抗癌藥物聯(lián)用

D-檸檬烯與其他抗癌藥物聯(lián)合使用的研究已有較長歷史，已發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯和普伐他?。?-羥基-3-甲基戊二酸-輔酶A還原酶抑制劑）合用時能有效抵抗不同類型的癌癥，且無毒副作用[59-60]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，D-檸檬烯與某些抗癌藥物合用不僅可以增強(qiáng)抗癌效果，還能減輕抗癌藥物對正常細(xì)胞的副作用。比如，D-檸檬烯與紫杉萜聯(lián)合使用不僅能加強(qiáng)紫杉萜的抗癌能力，還能減輕紫衫萜單獨使用對正常細(xì)胞造成的副作用[26]。Russo等[28]研究發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯與乙酸芳樟酯合用能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而任一成分單獨使用不能抑制成神經(jīng)細(xì)胞瘤。Rehman等[61]也發(fā)現(xiàn)，D-檸檬烯能抑制阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥，但D-檸檬烯是否可以和阿霉素共同使用，從而達(dá)到增強(qiáng)抗癌作用并減輕藥物損傷的效果還需進(jìn)一步研究。D-檸檬烯與其他抗癌藥物聯(lián)合使用已顯示了明顯的優(yōu)勢，探討D-檸檬烯與其他藥物聯(lián)合使用的機(jī)制及尋找更多的抗癌藥物與D-檸檬烯聯(lián)合使用具有進(jìn)一步研究價值。

此外，近幾年對D-檸檬烯抗癌機(jī)制的研究主要集中在乳腺癌、結(jié)腸癌的研究上，而對其他癌癥研究較少，但D-檸檬烯對不同癌癥的抵抗機(jī)制既具有相似之處也存在差異。因此，還需加大力度研究D-檸檬烯對其他癌癥比如肺癌、淋巴癌等的抵抗機(jī)制，以擴(kuò)大其抗癌譜，提高其利用價值。

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Recent Progress in Research on Anticancer Mechanism of D-Limonene

HUANG Qiaojuan, SUN Zhigao*, LONG Yong, SUN Qian
(Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China)

Abstract:D-Limonene, widely present in citrus, vegetables and spices, is a natural monoterpene. It plays an important role in many physiological processes, such as reducing inflammation, minimizing bacterial growth, and inhibiting cancer development. Anticancer effect is the major function of D-limonene by participating in chemical prevention, cell-cycle inhibition, induction of apoptosis, and defense against cancer proliferation and invasiveness. D-Limonene has great prospects for clinical application for its wide distribution, excellent safety, and convenient administration. Therefore, it is worthy of further exploration.

Key words:D-limonene; cancer; anticancer mechanism; apoptosis

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507044

中圖分類號：TS255.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0240-05

*通信作者：孫志高（1964—），男，副研究員，本科，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：cpro@cric.cn

作者簡介：黃巧娟（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：hqj1027003283@163.com

基金項目：2012年度國家星火計劃項目（2012GA811001）

收稿日期：2014-04-04