徐小青，秦清娟，吳 雨，鐘 耕,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

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羧甲基魔芋葡甘聚糖理化性質(zhì)及對(duì)腸道發(fā)酵環(huán)境的影響

徐小青1，秦清娟1，吳 雨1，鐘 耕1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

摘 要：為深入了解羧甲基魔芋葡甘聚糖（carboxymethyl konjac glucomannan，CMK）的性能，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其基本理化性質(zhì)進(jìn)行測定，并分析其對(duì)腸道發(fā)酵環(huán)境的影響，初步判定其是否會(huì)對(duì)腸道健康產(chǎn)生危害。結(jié)果表明：CMK的表觀特性與魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）較為相似，仍呈粉狀，無臭無味，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，但黏度顯著降低，灰分含量顯著增加。此外，通過體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，CMK對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氣量和短鏈脂肪酸含量均無顯著影響（P＞0.05），且對(duì)NH3-N含量有顯著的降低作用，對(duì)大腸桿菌、雙歧桿菌既無促生作用也無抑制作用，而對(duì)乳酸菌則顯示了一定的促生作用?？傊?，相較KGM對(duì)腸道健康潛在的促進(jìn)作用，CMK則對(duì)腸道健康無損害作用，也可說明它對(duì)腸道發(fā)酵環(huán)境是安全的。

關(guān)鍵詞：羧甲基魔芋葡甘聚糖；理化性質(zhì)；體外發(fā)酵；短鏈脂肪酸；微生物

據(jù)統(tǒng)計(jì)，食品包裝材料約占包裝產(chǎn)業(yè)的70%左右[1]。在破壞環(huán)境的垃圾中以塑料包裝材質(zhì)污染最為嚴(yán)重，其中有很大一部分來源于食品塑料包裝廢棄物，面對(duì)如此嚴(yán)峻的包裝污染現(xiàn)狀，已使得開發(fā)天然生物材料可食性包裝材料成為食品包裝領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）因其特殊的流變學(xué)性能、成膜性能以及生物活性，已得到廣泛應(yīng)用[2]，1994年歐美國家相繼立法批準(zhǔn)其為健康食品及食品添加劑[3]，同時(shí)，它也是目前所發(fā)現(xiàn)的自然界中黏度最高的多糖，但因其溶脹時(shí)間長，水溶膠穩(wěn)定性差等特點(diǎn)，阻礙了其在很多領(lǐng)域的應(yīng)用。羧甲基魔芋葡甘聚糖（carboxymethyl konjac glucomannan，CMK）是由KGM經(jīng)化學(xué)醚化改性而得，并且因其引入了親水的羧甲基基團(tuán)，其溶解性、成膜性、抑菌性能大大提高[4]，可以應(yīng)用于包裝、印染等方面[5]。并且相較于KGM，制成的膜溶解性較好，在熱水中可完全溶解[6]，用其制成熱敏性可食膜，可用于奶粉、速溶咖啡的包裝，是符合環(huán)境友好的天然生物材料。KGM已有很長的食用史，但其改性后所得CMK的食用性還有待研究，本實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)腸道發(fā)酵環(huán)境的影響。

大量研究表明，腸道的健康與短鏈脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA）產(chǎn)量、腸道pH值、腸道中氨含量以及細(xì)菌活性等方面密切相關(guān)[7]，用動(dòng)物腸道內(nèi)容物作為接種物進(jìn)行體外發(fā)酵則是評(píng)價(jià)發(fā)酵底物對(duì)上述幾項(xiàng)指標(biāo)的一種經(jīng)濟(jì)、簡捷的方法，并已廣泛用于消化道微生物的發(fā)酵特性研究[8]。本研究利用KGM羧甲基化改性所制得的CMK作為原料，檢測其基本理化性質(zhì)，分析其對(duì)腸道發(fā)酵環(huán)境的影響，為CMK的安全應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑、培養(yǎng)基與動(dòng)物

CMK由本實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法參照夏玉紅等[9]的微波制備法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以改性前的KGM為對(duì)照。

乙酸、丙酸、丁酸、戊酸 阿拉丁試劑（上海）有限公司；所用化學(xué)試劑除注明外，均為分析純。

選擇性培養(yǎng)基：BBL培養(yǎng)基（雙歧桿菌） 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；MRS培養(yǎng)基（乳酸菌） 杭州微生物試劑有限公司；EMB培養(yǎng)基（大腸桿菌） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；發(fā)酵培養(yǎng)基[10-11]：1 g胰蛋白胨，1 g酵母浸粉，微量元素0.1 mL（132 g/L CaCl2·2H2O、100 g/L MnSO4·4H2O、80 g/L FeC13·6H2O），常量元素200 mL（9.45 g/L Na2HPO4、6.2 g/L KH2PO4、0.6 g/L MgSO4·7H2O），緩沖溶液200 mL（4 g/L (NH4)HCO3、35 g/L NaHCO3），純水500 mL。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明種（Kunming mice，KM）小鼠（SCXK（渝）2012-0003），由重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，腸道內(nèi)容物在無菌條件下從健康成年KM小鼠盲腸中取出。

1.2儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；NDJ-5S數(shù)字式黏度計(jì) 上海精天電子儀器有限公司；HunterLab色差計(jì) 美國UltraScan公司；Spectrum 100紅外光譜分析儀 美國Perkin Elmer公司；PHS-3C pH計(jì) 上海盛磁儀器有限公司；FA 1004電子天平上海精科天平廠；Sepctrumlab22可見分光光度計(jì)上海棱光技術(shù)有限公司；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋 日本Kagoshima Seisakusyo公司；厭氧培養(yǎng)箱 美國Sheldon Manufacturing股份有限公司；ZWY-1112B恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱 上海智城儀器制造有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；GC-2010氣相色譜儀 日本島津公司；單人雙面凈化工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司。

1.3方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定方法

1.3.1.1 取代度（degree of substitution，DS）測定

采用酸洗法[12-13]測定取代度。

1.3.1.2 表觀黏度測定

參照NY/T 494—2010《魔芋粉》的方法[14]測定表觀黏度。

1.3.1.3 色度和白度值測定

參考Benjakul等[15]和GB/T 22427.6—2008《淀粉白度測定》方法[16]，采用HunterLab UltraScan Pro色差儀進(jìn)行測定。

1.3.1.4 水分含量測定

參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》[17]。

1.3.1.5 灰分的測定

參照GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的測定》[18]。

1.3.1.6 pH值測定

參照GB/T 10468—89《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》[19]。

1.3.1.7 傅里葉紅外光譜分析

將待測樣于105 ℃干燥后，冷卻，采用KBr壓片法，樣品與KBr按1∶100的比例充分研磨、混勻、壓片，在4 000～450 cm-1區(qū)間掃描，得到紅外吸收光譜，分析所含基團(tuán)的異同[20-22]。

1.3.2 CMK對(duì)腸道發(fā)酵環(huán)境的影響性評(píng)價(jià)

無菌條件下取出健康成年KM小鼠盲腸內(nèi)容物，裝入預(yù)先滅菌的50 mL帶蓋離心管中，稱質(zhì)量后，以9 倍生理鹽水稀釋，迅速混勻后過濾。發(fā)酵液培養(yǎng)：設(shè)置CMK添加量為1%（CMK組），KGM添加量為1% （KGM組），同時(shí)設(shè)定0.5% CMK＋0.5%葡萄糖（Glu）底物組（CMK＋Glu組），1% Glu陽性對(duì)照組（Glu組），以及不含碳源（即不含CMK和Glu）的陰性對(duì)照組（空白組），接種體積分?jǐn)?shù)10%的糞懸液至發(fā)酵培養(yǎng)基，搖勻，于密閉培養(yǎng)管（專用注射器）中37 ℃厭氧振蕩培養(yǎng)24 h。取適量進(jìn)行微生物分離鑒定，然后以20 g/L CuSO475 μL終止發(fā)酵。

1.3.2.1產(chǎn)氣量測定[23]

向培養(yǎng)管加入發(fā)酵培養(yǎng)液50 mL，放置到恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)計(jì)時(shí)，在2、4、6、8、12、14、16、24 h各時(shí)間點(diǎn)取出培養(yǎng)管并快速讀數(shù)記錄。當(dāng)?shù)侥骋粫r(shí)間點(diǎn)讀數(shù)超過100 mL時(shí)，在讀數(shù)后及時(shí)排氣并記錄排氣后的刻度值。

1.3.2.2 pH值測定

取終止發(fā)酵后的發(fā)酵液樣品5 mL測pH值。

1.3.2.3 游離氨（NH3-N）含量測定[24-25]

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：分別取NH4Cl溶液0、16、32、48、64、80 μL，不足80 μL以水補(bǔ)足，加入2.5 mL苯酚顯色劑，再加入2 mL次氯酸鹽試劑，37 ℃水浴15 min，室溫保存30 min，于625 nm波長處測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

發(fā)酵液樣品于4 000 r/min條件下離心5 min，吸取上清液80 μL至試管中，依次加入2.5 mL苯酚顯色劑及2 mL次氯酸鹽試劑，振蕩均勻，37 ℃水浴15 min，室溫保存30 min，于625 nm波長處測定吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NH3-N含量。

1.3.2.4短鏈脂肪酸含量測定[26]

取5 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，3 500 r/min離心5 min，將上清液經(jīng)0.22 μm超濾膜過濾后，取2 mL濾液于5 mL離心管中，再加入200 μL體積分?jǐn)?shù)50%的硫酸，1 mL無水乙醚，充分振蕩，于4 ℃冰箱中保存1 h，取上層有機(jī)溶劑經(jīng)氣相色譜測定。

氣相色譜條件：Rtx-wax柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度220 ℃；壓力74.5 kPa；總流量10.7 mL/min；柱流量0.77 mL/min，線速率22.9 cm/s，柱溫90.0 ℃，平衡時(shí)間0.5 min，5 ℃/min升溫至150 ℃，保留時(shí)間7 min；進(jìn)樣量1 μL；吹掃流量3.0 mL/min；分流比8∶9；檢測器溫度230 ℃，尾吹流量40.0 mL/min，氫氣流量40.0 mL/min，空氣流量400.0 mL/min。

1.3.2.5 微生物分離鑒定

取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL于裝有9 mL無菌生理鹽水的試管內(nèi)，依次10 倍稀釋至10-7。取10-5、10-6、10-73 個(gè)稀釋度，進(jìn)行平板培養(yǎng)，接種量為100 μL。大腸桿菌培養(yǎng)選用EMB培養(yǎng)基，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)。雙歧桿菌和乳酸桿菌分別選用BBL培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基，在厭氧培養(yǎng)箱37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。結(jié)果以lg（CFU/g）表示。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18及Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)，方差及顯著性水平分析采用One way ANVOA。

2　結(jié)果與分析

2.1理化指標(biāo)

2.1.1 基本性質(zhì)分析

表1　KGM和CMK的基本理化性質(zhì)（±s）Table 1 Physicochemical properties of KGM and CMK (±s)

表1　KGM和CMK的基本理化性質(zhì)（±s）Table 1 Physicochemical properties of KGM and CMK (±s)

注：—. 無測定值。

樣品　取代度　表觀黏度/（mPa·s）　水分含量/%　灰分含量/%　pH KGM　—　48 650±50　10.56±0.46　1.98±0.14　6.45±0.18 CMK 0.34±0.01　171±4　11.68±0.30　4.73±0.33　6.67±0.14

制備所得C MK外觀呈粉狀，無臭無味，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。由表1可知，KGM 的表觀黏度為48 650 mPa·s，而經(jīng)改性后所得的CMK表觀黏度僅有171 mPa·s，降低了200多倍，這可能是由于反應(yīng)過程中，在堿和醚化劑的作用下，KGM 的分子鏈發(fā)生部分?jǐn)嗔?，分子質(zhì)量減小的緣故。并且因其黏度降低，制成熱敏性可食膜后，隨著產(chǎn)品一起沖泡溶解后，對(duì)產(chǎn)品的口感影響就比較小，不會(huì)增大產(chǎn)品的黏度，而且其本身無臭無味，對(duì)產(chǎn)品的氣味也不會(huì)產(chǎn)生影響。此外，改性后CMK的灰分含量與KGM相比，也有顯著提高，這可能與改性所加入的化學(xué)物質(zhì)有關(guān)，改性加入的氫氧化鈉和氯乙酸，會(huì)生成很多氯化鈉，便造成了CMK中的無機(jī)鹽偏多，而導(dǎo)致灰分增大。

2.1.2 色度值和白度值

表2　CMK和KGM的色度值和白度值（±s）Table 2 Color parameters and whiteness of CMK and KGM ((±s)

表2　CMK和KGM的色度值和白度值（±s）Table 2 Color parameters and whiteness of CMK and KGM ((±s)

樣品　Lab　白度KGM　86.30±0.45　0.05±0.02　10.42±0.13　82.79±0.38 CMK　80.27±0.27　2.54±0.08　14.39±0.28　75.45±0.36

由表2可知，KGM的L、a、b值與改性后的樣品CMK差異顯著，說明兩者的亮度、紅度、黃度值在改性的過程中都受到了一定的變化。其中，CMK的亮度值雖然略有降低，但兩者的亮度值都比較大，即改性前后亮度都很高；KGM的a值只有0.05，說明其紅度極低；CMK的b值高于KGM，說明其黃度較高。在白度方面，雖然CMK的白度不及KGM，但相差并不是特別大，可見CMK在色度和白度方面并不遜色，制成包裝膜后，CMK膜的透明度并不會(huì)比KGM膜差。

2.1.3 紅外光譜分析

圖1　CMK和KGM的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of KGM and CMK

由圖1可知，KGM與CMK的結(jié)構(gòu)有較大的差異，1 737.05 cm－1處吸收峰為KGM乙?；蠧＝O基團(tuán)的伸縮振動(dòng)特征吸收，而CMK光譜在該處無峰，表明其乙?；驯幻摮珻MK在1 610.73 cm－1處明顯增強(qiáng)的吸收峰，則表明羧甲基基團(tuán)已經(jīng)連接到KGM分子上。

2.2CMK對(duì)腸道微生態(tài)的影響

2.2.1 發(fā)酵產(chǎn)氣量變化趨勢

圖2　不同樣品對(duì)小鼠腸道內(nèi)容物體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響Fig.2 Effects of different samples on gas production during in vitro fermentation

由圖2可知，CMK組的發(fā)酵產(chǎn)氣量與空白組無顯著差異，CMK＋Glu組的產(chǎn)氣量則介于空白組與Glu組之間，說明CMK可能無法被腸道微生物分解，因而對(duì)腸道健康不會(huì)產(chǎn)生任何影響。相較于CMK，1% KGM在前12 h內(nèi)幾乎不產(chǎn)氣，后期產(chǎn)氣量迅速增加，而Glu組的產(chǎn)氣量在后期基本不變，這可能是因?yàn)镵GM分子質(zhì)量大，分解利用需要一定的反應(yīng)時(shí)間，也顯示了其一定的腸道益生潛能。

2.2.2 發(fā)酵液pH值和NH3-N含量

圖3　不同樣品對(duì)發(fā)酵液pH值的影響Fig.3 Effects of different samples on pH in f ermented products

圖4　不同樣品對(duì)發(fā)酵液NH3-N含量的影響Fig.4 Effects of different samples on NH3-N contents in fermented products

發(fā)酵液pH值的變化主要受發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的有機(jī)酸和NH3-N含量的影響，其值的升降表明有機(jī)酸含量或NH3-N含量可能發(fā)生了顯著的變化[26]。各發(fā)酵液的初始pH值為7.84，由圖3可知， CMK組與空白組pH值無顯著差異（P＞0.05），CMK＋Glu組的pH值則與Glu組無顯著差異（P＞0.05），這說明CMK對(duì)腸道微生物的干擾很小，幾乎可以忽略，而KGM組相較于空白組，pH值顯著降低（P＜0.05）。對(duì)比圖3、4，可見相較于空白組，各組pH值與NH3-N含量的升降趨勢是相對(duì)應(yīng)的。

2.2.3 發(fā)酵液短鏈脂肪酸含量變化趨勢

圖5　不同樣品對(duì)發(fā)酵液短鏈脂肪酸含量的影響Fig.5 Effects of different samples on the contents of acetic acid, propanic acid, butyric acid and pentanoic acid in fermented products

從圖5可知，相比于空白組，KGM組的發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量均顯著增加，而CM K組則與空白組無顯著差異（P＞0.05）。此外，CMK＋Glu組也與Glu組基本無顯著差異（P＞0.05），并與空白組相比有所提高。此結(jié)果表明，KGM經(jīng)改性后得到的CMK，由于結(jié)構(gòu)的改變，部分功能性也發(fā)生了變化，腸道益生性能降低，但與空白組相比并無顯著差異，也說明CMK不會(huì)影響到腸道菌群的正常生長。

2.2.4 發(fā)酵液微生物數(shù)量變化趨勢

圖6　不同樣品對(duì)發(fā)酵液中微生物組成的影響Fig.6 Effects of different samples on Lactobacillus, Bifi dobacterium and Enterobacter in fermented products

由圖6可知，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的幾種腸道菌中，CMK組的大腸桿菌數(shù)和雙歧桿菌數(shù)均與空白組無顯著差異（P＞0.05），添加CMK+Glu組與Glu組亦無顯著差異（P＞0.05），再次說明了CMK對(duì)腸道菌群的影響很小。相較于空白組，1% CMK顯示出一定的乳酸菌增殖作用，說明CMK可能會(huì)對(duì)乳酸菌有一定的促生作用，并不會(huì)損害腸道健康。而相較于空白組，1% KGM則顯著增加了雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量，顯示了其潛在的益生性能。

3　結(jié) 論

本研究結(jié)果 表明，KGM經(jīng)化學(xué)醚化改性后所得CMK表觀性能與KGM較為接近，但黏度有大幅度的降低。此外，CMK對(duì) 盲腸內(nèi)容物發(fā)酵液中有益菌（雙歧桿菌、乳酸菌）和有害菌（大腸桿菌）的影響較小，產(chǎn)氣量及pH值都與空白組無顯著差異（P＞0.05），NH3-N含量略有降低，幾乎不會(huì)對(duì)腸道微生態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響，而KGM則可以顯著提高有益菌的數(shù)量，提高短鏈脂肪酸濃度，降低NH3-N濃度及pH值。而CMK+Glu組在有益菌與有害菌的數(shù)量、pH值、NH3-N濃度以及短鏈脂肪酸的濃度上，與Glu組皆無顯著差異，僅產(chǎn)氣量約為Glu組的一半，進(jìn)一步證明CMK對(duì)腸道健康的影響甚微。因而，將CMK作為可食性膜的原料對(duì)腸道發(fā)酵環(huán)境是安全的。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可看出，相比于KGM，CMK對(duì)腸道益生菌的促生性能減弱，但因其溶解度的加強(qiáng)，使之更適合做熱敏性膜的原料，黏度的降低則減小了包裝膜對(duì)食品感官性能的影響，更適合作為可食膜的原料。

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Physico-chemical Properties of Carboxymethyl Konjac Glucomannan and Its Effect on Intestinal Fermentation Environment

XU Xiaoqing1, QIN Qingjuan1, WU Yu1, ZHONG Geng1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

Abstract:Carboxymethyl konjac glucomanna n (CMK) made from konjac glucomannan (KGM) from Amorphophallus bulbifer shows a good film-forming property. CMK-KGM blend membrane has a better strength of extension and elongation at break and a similar clarity when compared to the film made from simplex KGM. However, there has been no published report regarding the intestinal health effect of CMK. For better understanding CMK, we investigated its physico-chemical properties and fermentation characteristics in vitro. The results showed similar apparent properties between KGM and CMK. Both of them were odorless, soluble in water and insoluble in ethanol, ether and other organic solvents, but CMK had significantly higher ash content and significantly lower viscosity. Moreover, results of in vitro fermentation showed that CMK showed very slight effect on gas production or the content of short-chain fatty acid (SCFA) but resulted in a significant reduction in NH3-N con tent. CMK neither promoted nor inhibited the growth of Bifi dobacterium or E. coli, but had a promoting effect on the growth of Lactobacillus. To conclude, while the potential role of KGM in promoting intestinal health, CMK has no adverse effect on intestinal health.

Key words:carboxymethyl konjac glucomannan (CMK); physico-chemical properties; in vitro fermentation characteristics; short-chain fatty acid (SCFA); microbe

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507032

中圖分類號(hào)：TS202.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0172-05

*通信作者：鐘耕（1964—），男，教授，博士后，研究方向?yàn)榧Z食、油脂與植物蛋白。E-mail：zhongdg@126.com

作者簡介：徐小青（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：xqing2008@126.com

基金項(xiàng)目：重慶市“121”科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（cstc2014zktjccxyyB0022）

收稿日期：2014-06-04