蔡子康，王曉霞，秦曉杰，楊 蓉，司琳媛，肖紅梅*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

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果蔬生防菌葡萄有孢漢遜酵母CM2糖蜜培養(yǎng)基的優(yōu)化

蔡子康，王曉霞，秦曉杰，楊 蓉，司琳媛，肖紅梅*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

摘 要：以葡萄有孢漢遜酵母CM2為研究對象，細(xì)胞生物量為測定指標(biāo)，利用甘蔗糖蜜作為發(fā)酵原料，對糖蜜培養(yǎng)基的優(yōu)化進(jìn)行較為全面的探討。采用煮沸法、磷酸法、硫酸法、活性炭法、亞鐵氰化鉀法對糖蜜進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果表明硫酸處理法優(yōu)于其他處理方法。通過單因素試驗研究糖蜜質(zhì)量濃度、氮源及其添加量、初始pH值、磷酸鹽、硫酸鎂、氯化鈉等培養(yǎng)基組分對CM2生長的影響；采用Plackett-Burman試驗設(shè)計、最陡爬坡試驗和中心組合試驗設(shè)計對培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化培養(yǎng)基組分：預(yù)處理后糖蜜78.9 g/L、酵母粉2.2 g/L、初始pH 6.0。通過驗證實驗獲知與PDB培養(yǎng)基相比，優(yōu)化后糖蜜培養(yǎng)基使CM2生物量提高了83.1%。

關(guān)鍵詞：葡萄有孢漢遜酵母；甘蔗糖蜜；Plackett-Burman試驗設(shè)計；培養(yǎng)基；生物量

酵母菌是一種單細(xì)胞真核微生物，是子囊菌、擔(dān)子菌等單細(xì)胞真菌的統(tǒng)稱[1]。酵母菌適宜生長在含糖量較高的偏酸性（pH 4.0～7.0）環(huán)境中，其本身含有大量的蛋白質(zhì)和豐富的維生素，營養(yǎng)要求不高，能夠迅速生長[2]。在利用拮抗酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)菌體及代謝產(chǎn)物時，培養(yǎng)基組分和配比對酵母菌的生長、發(fā)育、代謝以及發(fā)酵生產(chǎn)工藝有很大的影響，因此選擇合適的培養(yǎng)基成分及優(yōu)化培養(yǎng)基顯得尤為重要。廢糖蜜是制糖業(yè)的一種主要副產(chǎn)物，價格低廉，含有豐富的適宜酵母菌生長的營養(yǎng)成分，總糖和蔗糖含量均很高，是發(fā)酵生產(chǎn)酵母菌的良好原料，現(xiàn)已作為一種生產(chǎn)原料被廣泛用于發(fā)酵領(lǐng)域[3]。利用甘蔗糖蜜作為碳源規(guī)?；囵B(yǎng)酵母菌，具有重要意義。

葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）CM2是本實驗室從草莓果實上分離篩選獲得的拮抗酵母菌，前期的研究表明其對草莓[4]和葡萄[5-6]果實采后病害具有良好的抑制效果，具有良好的商業(yè)化前景。拮抗酵母菌商業(yè)化的發(fā)展受生產(chǎn)成本的影響，而生產(chǎn)成本很大程度上來源于發(fā)酵培養(yǎng)基。因此，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基是從實驗室到商業(yè)化生產(chǎn)的必要環(huán)節(jié)[7-8]。目前的研究表明，在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基的方法中，Plackett-Burman法和響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）取得了良好的效果，其中Plackett-Burman法可以從多因子中篩選出主要影響因子，而RSM法通過對顯著因子的優(yōu)化評價，可快速有效地確定最佳條件[9]。本實驗以CM2為研究對象，以甘蔗糖蜜為培養(yǎng)基碳源，研究糖蜜預(yù)處理方法及糖蜜培養(yǎng)基各組分對CM2生長的影響，最后利用Plackett-Burman和RSM法對培養(yǎng)基各組分進(jìn)行優(yōu)化，為發(fā)酵工藝提供數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

供試菌株葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）CM2為本課題組從草莓果實表面分離鑒定并培養(yǎng)保存[4]。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂17 g/L，121 ℃滅菌20 min。糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基：將未處理或預(yù)處理的甘蔗糖蜜稀釋至適宜濃度，并按實驗要求加入相關(guān)成分，121 ℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

HVE-50自動滅菌鍋 日本Hirayama有限公司；SWCJ-ID型單人凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Nikon顯微鏡 日本尼康公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠；GL-21MC高速冷凍離心機(jī) 湘潭湘儀儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1 供試菌種的培養(yǎng)

從4 ℃保存菌種中挑取菌落，在PDA培養(yǎng)基上劃線，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，分離單菌落，活化兩代，將拮抗酵母菌從PDA斜面上挑取一環(huán)菌體轉(zhuǎn)接于含有100 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中， 28 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)18 h，做種子液。將培養(yǎng)好的種子液按2%接種量接入裝液量為100 mL的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，每3 h測定600 nm波長處的光密度（OD600 nm）值，以未接種的酵母液體培養(yǎng)基校正紫外-可見分光光度計的零點。以測定的OD600 nm為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制酵母菌的生長曲線。由于發(fā)酵液濃度較大，需要適當(dāng)稀釋后測定，以下實驗同。

1.3.2 糖蜜的預(yù)處理方法比較

對照：糖蜜用去離子水（1∶1，m/m，下同）稀釋后，離心，取上清液。

煮沸法：糖蜜用去離子水稀釋后，加熱煮沸20 min，離心，取上清液。

磷酸法：糖蜜用去離子水稀釋后，加熱煮沸，加濃磷酸至pH 2.0～3.0，靜置過夜離心，取上清液加入新配制的石灰乳回調(diào)至pH 6.0左右，65～70 ℃保溫30 min，加0.8%活性炭，離心，取上清液。

硫酸法：糖蜜用去離子水稀釋后，再加硫酸，調(diào)pH 2.0～3.0，95～100 ℃加熱 20 min，靜置過夜離心，取上清液加入新配制的石灰乳回調(diào)至pH 6.0左右，65～70 ℃保溫30 min，加0.8%活性炭，離心，取上清液。

亞鐵氰化鉀法：糖蜜用去離子水稀釋后，加0.1%亞鐵氰化鉀，調(diào)節(jié)酸堿度至pH 6.5，煮沸30 min后，同時加1%活性炭，離心，取上清液。

活性炭法：糖蜜用去離子水稀釋后，加1%顆粒炭吸附處理，離心，取上清液。

糖蜜中總糖及還原糖含量測定：總糖含量測定參照SB/T 10203—1994《果汁通用試驗方法》，將糖蜜樣品稀釋后用濃鹽酸處理，處理組直接用滴定法測總糖含量；還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法測定[10]。

將預(yù)處理后的糖蜜稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，按2%接種量將種子液接入裝液量為100 mL的250 mL搖瓶中，28 ℃、180 r/min條件下每隔12 h測定酵母菌OD600 nm值。

選取糖蜜預(yù)處理效果最好的方法，測定拮抗酵母菌生長曲線。

1.3.3 培養(yǎng)基組分篩選單因素試驗

1.3.3.1 糖蜜質(zhì)量濃度篩選

將硫酸法處理后的糖蜜用去離子水稀釋，調(diào)整糖蜜質(zhì)量濃度分別為40、50、60、70、80、90 g/L，作為培養(yǎng)基。按2%接種量將酵母菌種子液接入250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h后測定發(fā)酵液OD600 nm值，比較不同糖蜜質(zhì)量濃度對拮抗酵母菌生長的影響。

1.3.3.2 初始pH值篩選

分別用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)整拮抗酵母菌液體培養(yǎng)基的pH值為4、5、6、7、8。按1.3.3.1節(jié)中的接種量和培養(yǎng)條件實驗，以考察初始pH值對拮抗酵母菌生長的影響。

1.3.3.3 氮源篩選

加入不同氮源（魚蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、硝酸鉀、尿素），在不同添加量（0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L）的條件下，按1.3.3.1節(jié)中的接種量和培養(yǎng)條件進(jìn)行實驗，以考察不同氮源對酵母菌生長的影響。

1.3.3.4 無機(jī)鹽篩選

按1.3.3.1節(jié)中的接種量和培養(yǎng)條件，分別選KH2PO4和K2HPO4質(zhì)量濃度均為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L；MgSO4質(zhì)量濃度為0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L；NaCl質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L?？疾鞜o機(jī)鹽對酵母菌生長的影響。

1.3.4 多種試驗設(shè)計法優(yōu)化糖蜜培養(yǎng)基

1.3.4.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

采用Design-Expert進(jìn)行Plackett-Burman試驗設(shè)計，每個因素取高低2 個水平，分別以“＋1”和“－1”表示，試驗因子高低水平的選取以單因素試驗結(jié)果為參考。接種量和培養(yǎng)條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.4.2 最陡爬坡試驗設(shè)計

由Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出對拮抗酵母菌生長的主要影響因子，根據(jù)回歸方程中各因子回歸系數(shù)大小及正負(fù)確定最陡爬坡的方向和步長，一般爬坡步長為Plackett-Burman試驗設(shè)計步長的1/3～1 倍[11]。接種量和培養(yǎng)條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.4.3 中心組合試驗設(shè)計

在最陡爬坡試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用具有旋轉(zhuǎn)性的中心組合試驗對顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，每個因素取3個水平，以“－1”、“0”、“＋1”編碼。接種量和培養(yǎng)條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.5 拮抗酵母菌菌數(shù)的檢測

拮抗菌酵母的總菌數(shù)采用血球計數(shù)板進(jìn)行觀察、統(tǒng)計。拮抗酵母菌活菌數(shù)用稀釋平板法記數(shù)，即將不同濃度梯度的菌液在PDA上鋪板，放置28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計菌落個數(shù)[12]。

1.3.6 拮抗酵母菌生物量的測定

1.3.6.1 細(xì)胞干質(zhì)量法

取發(fā)酵液10 mL，6 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗滌沉淀3 次，所得酵母菌在105 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，換算成每毫升發(fā)酵液的菌體量，即為細(xì)胞生物量[13]。

1.3.6.2 比色法

在600 nm波長處測發(fā)酵液的光密度值，以未接種的酵母液體培養(yǎng)基作參照[14]。

1.3.7 驗證實驗

分別采用PDB培養(yǎng)基、無預(yù)處理糖蜜培養(yǎng)基、預(yù)處理糖蜜培養(yǎng)基及優(yōu)化后的糖蜜培養(yǎng)基進(jìn)行拮抗酵母菌搖瓶發(fā)酵實驗，比較拮抗酵母菌在不同培養(yǎng)基中的生長情況，驗證優(yōu)化結(jié)果的可靠性。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert和SAS軟件進(jìn)行Plackett-Burman和中心組合試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)統(tǒng)計，通過ANOVA方式，采用Duncan’s multiple range tests對不同處理之間的差異性在α＝0.05水平上進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1糖蜜預(yù)處理方法對拮抗酵母菌生長的影響

糖蜜成分復(fù)雜，含有重金屬離子、黑色素、膠體等不利于發(fā)酵的物質(zhì)[15]，因此糖蜜不能直接用于發(fā)酵，需要先進(jìn)行預(yù)處理，提高還原糖含量以利于酵母菌的生長。經(jīng)測定，糖蜜處理前總糖含量為43.7%，還原糖含量為20.4%；硫酸法預(yù)處理后總糖含量為34.1%，還原糖含量為29.5%。由此可知，糖蜜經(jīng)過預(yù)處理后還原糖含量明顯提高，有利于酵母菌的生長發(fā)酵。 由圖1可知，硫酸處理方法均優(yōu)于其他處理方法。這是因為在糖蜜中加入硫酸，一方面可以分解膠體物質(zhì)，另一方面也可將多糖轉(zhuǎn)化為酵母菌直接利用的單糖，促進(jìn)其生長代謝；此外，硫酸法處理糖蜜在用加石灰乳回調(diào)pH值時可生成大量的石膏，過濾后得到澄清糖液[16]，便于酵母菌的生長。

圖1　糖蜜預(yù)處理方法對CM2生長的影響Fig.1 Effect of molasses pretreatment on biomass production of CM2

2.2拮抗酵母菌生長曲線

圖2　拮抗酵母菌生長曲線Fig.2 Growth curve of the antagonistic yeast CM2

由圖2可知，CM2在糖蜜培養(yǎng)基中延滯期很短，3～12 h為指數(shù)生長期，此階段細(xì)胞分裂速率快，酵母個數(shù)呈幾何級數(shù)生長狀態(tài)，12～21 h處于減速時期，酵母菌細(xì)胞數(shù)目雖然增加，但增加速率減緩，到21 h時CM2細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值，21 h后生長處于穩(wěn)定期，細(xì)胞數(shù)目基本保持不變。在后續(xù)實驗中，選擇細(xì)胞生物量比較穩(wěn)定的時間作為培養(yǎng)時間，故選擇CM2培養(yǎng)時間為24 h。

2.3單因素試驗篩選培養(yǎng)基組分

2.3.1 糖蜜質(zhì)量濃度篩選

由圖3可知，糖蜜質(zhì)量濃度為60～70 g/L時，菌體生物量較大。考慮生產(chǎn)原料節(jié)約利用原則，在后續(xù)實驗中選擇60～70 g/L作為CM2生長最適糖蜜質(zhì)量濃度。

圖3　糖蜜質(zhì)量濃度對拮抗酵母菌生長的影響Fig.3 Effect of molasses concentration on the growth of the antagonistic yeast

2.3.2 初始pH值篩選

圖4　初始pH值對拮抗酵母菌生長的影響Fig.4 Effect of initial pH on the growth of the antagonistic yeast

培養(yǎng)基pH值通過影響酵母細(xì)胞對培養(yǎng)基營養(yǎng)基質(zhì)的利用效率進(jìn)而影響酵母菌的生長代謝[17-18]。由圖4可知，CM2對較寬的pH值范圍都具有良好的適應(yīng)性，CM2在pH值略偏酸性的培養(yǎng)基中生長狀況較好，且pH 5.0和pH 6.0基本無差異（P＞0.05）。

2.3.3 氮源篩選

表1　不同種類氮源對CM2生長的影響Table 1 Effect of different nitrogen sources on the growth of CM2OD600 nm

甘蔗糖蜜中所含氮源可部分被酵母菌利用，但其含氮量一般不足以滿足酵母菌生長的需要，通常都需要額外添加氮源以滿足菌體的生長[19-20]。由表1可知，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更有利于CM2酵母菌的生長。在相同添加量下，有機(jī)氮源中酵母粉的加入對酵母菌增殖作用最大，與其他幾種氮源相比差異顯著（P＜0.05）。無機(jī)氮源中只有硝酸鉀的加入使其生物量有小幅度的增加，而硫酸銨和尿素的加入反而對酵母菌的生長有所抑制；從添加量上分析，酵母粉添加量為1.0 g/L時，培養(yǎng)液的OD600 nm值最大，隨著添加量的增大，OD600 nm值反而下降。綜合考慮，后續(xù)優(yōu)化中選酵母粉的添加量在0.5～1.0 g/L較適宜。

2.3.4 磷酸鹽篩選

圖 55 KKHH2PPOO4對拮抗酵母菌生長的影響Fig.5 Effect of KH2PO4on the growth of the antagonistic yeast

由圖5可知，KH2PO4的加入未使酵母菌生物量有顯著增加（P＞0.05），故糖蜜培養(yǎng)基中不需要額外加KH2PO4。

圖 66 KK2HHPPOO4對拮抗酵母菌生長的影響Fig.6 Effect of K2HHPPOO4on the growth of the antagonistic yeast

由圖6可知，糖蜜培養(yǎng)基中加入K2HPO4后，未使酵母菌生物量有明顯增加（P＞0.05），故糖蜜培養(yǎng)基不需要額外加入K2HPO4。

2.3.5 MgSO4添加量篩選

圖7　MgSO4對拮抗酵母菌生長的影響Fig.7 Effect of MgSO4on the growth of the antagonistic yeast

由圖7可知，鎂離子的添加沒有使酵母菌的生物量顯著增加（P＞0.05），這說明糖蜜培養(yǎng)基中有足夠的鎂元素供酵母菌營養(yǎng)和代謝需要。

2.3.6 NaCl添加量篩選

圖8　NaCl對拮抗酵母菌生長的影響Fig.8 Effect of NaCl on the growth of the antagonistic yeast

由圖8可知，在NaCl添加量小于3.0 g/L時，酵母菌生長基本沒有受到影響（P＞0.05），當(dāng)NaCl添加量大于3.0 g/L時，酵母菌生長受到抑制，生物量明顯下降（P＜0.05），故以此糖蜜作為碳源的酵母培養(yǎng)基發(fā)酵過程不需要額外添加鈉離子。

2.4糖蜜培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

表2　Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 2 Plackett-Burman experimental design with Response values of CM2 biomass

表3　Plackett-Burman試驗方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for Response values of CM2 biomass from Plackett-Burman design

由表2、3可知，由Plackett-Burman試驗設(shè)計得出糖蜜質(zhì)量濃度和酵母粉添加量對CM2生物量的生成有顯著影響（P＜0.05），且均與CM2的生物量生成呈正相關(guān)，即隨著這兩個因素水平的增加，CM2生物量逐漸增加；其他各因素對結(jié)果影響并不顯著（P＞0.05）。通過回歸分析，得到CM2的多元回歸方程如下：

式中：Y為CM2生物量的預(yù)測值。該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.986 6，R2Adj=0.950 8，說明試驗中98.66%的變異可以由方程解釋，模型擬合良好，具有很高的可靠性。

2.4.2 最陡爬坡試驗設(shè)計

表4　最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Steepest ascent experimental design and results

由表4可知，CM2在步驟4和步驟5的時候有最大的生物生成量，故選擇這兩個步驟中糖蜜質(zhì)量濃度和酵母粉添加量的平均值作為中心組合試驗設(shè)計的中心點。

2.4.3 中心組合試驗設(shè)計

表5　中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Central composite design (CCD) and results

以CM2酵母生物生成量為響應(yīng)值，依據(jù)表5設(shè)計中的試驗結(jié)果，利用Design-Expert對結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到回歸方程為：

由表6可知，模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。同時，一次項對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），平方項對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其中酵母粉添加量比糖蜜質(zhì)量濃度對CM2的生物量影響更大。該模型的R2=0.968 9，R2=0.946 6，表明模型擬合度良好。

Adj

表6　中心組合試驗方差分析Table 6 Analysis of variance for the regression model

圖9　響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of yeast power and molasses concentration on the production of CM2 biomass

由圖9可知，回歸方程存在穩(wěn)定點，即極大值點。通過嶺嵴分析得到極大值所對應(yīng)各因素（X1，X2）的編碼值分別為（0.15，0.19），轉(zhuǎn)化為實際條件即為糖蜜質(zhì)量濃度（X1）78.9 g/L，酵母粉添加量（X2）2.2 g/L，在此條件下，CM2發(fā)酵液OD600 nm的預(yù)測值為0.90。

2.5驗證實驗

圖10　不同培養(yǎng)基中拮抗酵母菌CM2的生物量Fig.10 Biomass production of the antagonistic yeast in different culture media

由圖10可知，優(yōu)化后的糖蜜培養(yǎng)基大大提高了拮抗酵母菌的生物量。優(yōu)化后糖蜜培養(yǎng)基CM2的生物量為（11.9±0.9） g/L，PDB培養(yǎng)基的生物量為（6.5±0.5） g/L，與PDB培養(yǎng)基比，優(yōu)化后的糖蜜培養(yǎng)基使CM2生物量提高了83.1%。說明試驗設(shè)計可靠，優(yōu)化糖蜜培養(yǎng)基可作為下一步試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

3　結(jié)論與討論

糖蜜作為碳源已成功應(yīng)用于拮抗酵母Pichia anomala[21]、P. agglomerans[22]及Candida sake[23]的發(fā)酵生產(chǎn)過程。但目前還沒有將糖蜜應(yīng)用于拮抗酵母H. uvarum發(fā)酵生產(chǎn)的相關(guān)報道。在本實驗中，硫酸預(yù)處理后的糖蜜作為碳源使酵母菌的生物量有了較大幅度的提升，這一結(jié)果與對Rhodosporidium paludigenum[13]及Blakeslea tripora[24]培養(yǎng)基優(yōu)化的結(jié)果相類似。甘蔗糖蜜含氮量比較低（一般在0.4%～1.5%左右），而酵母粉中含有氨基酸、水溶性維生素、多肽及生長因子等多種營養(yǎng)成分，是許多微生物生長的良好氮源[25]，在發(fā)酵工藝中發(fā)揮著重要的作用。本實驗中，酵母粉對CM2具有良好的促進(jìn)作用，并且通過響應(yīng)面優(yōu)化得出酵母粉的使用量均低于3 g/L，較低的酵母粉使用量也表明了其工業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)可行性。初始pH值是影響酵母菌生長的另一重要因素，本實驗中單因素試驗結(jié)果表明CM2對較寬pH值范圍均具有良好的適應(yīng)性，且在pH 6.0時生長的最好。通過響應(yīng)面優(yōu)化后，初始pH值的大小對CM2的生物量并未顯示出顯著影響，這是因為甘蔗糖蜜在用硫酸法預(yù)處理時最終的pH值是調(diào)至6.0左右的，本實驗中所用的甘蔗糖蜜價格低廉，優(yōu)化后的糖蜜培養(yǎng)基相對實驗室常用的PDB培養(yǎng)基成本低，甘蔗糖蜜的使用不僅提高了酵母菌的生產(chǎn)量，同時也降低了生產(chǎn)成本，便于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)。

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Optimization of Molasses Medium Composition for Hanseniaspora uvarum CM2 as a Biocontrol Yeast

CAI Zikang, WANG Xiaoxia, QIN Xiaojie,YANG Rong, SI Linyuan, XIAO Hongmei*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:The composition of a sugarcane molasses-based medium used to culture Hanseniaspora uvarum CM2 was optimized for enhanced biomass production. The molasses was pretreated by boiling or adding phosphoric acid, sulfuric acid, potassium ferrocyanide and activated carbon, respectively. Comparing their impacts on the growth of the antagonistic yeast CM2, sulfuric acid addition was considered the method of choice. Molasses concentration, the type and concentration of nitrogen source, initial pH, phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride were studied for their influence on the biomass production of CM2 by single factor design. Plackett-Burman design and response surface methodology were used to optimize the medium components as pretreated molasses 78.9 g/L, yeast powder 2.2 g/L and initial pH 6.0. The optimal medium could result in an 83.1% enhancement in the biomass production of CM2.

Key words:Hanseniaspora uvarum; sugarcane molasses; Plackett-Burman experimental design; medium; biomass

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507022

中圖分類號：TS201.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0117-07

*通信作者：肖紅梅（1970—），女，副教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工。E-mail：xhm@njau.edu.cn

作者簡介：蔡子康（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：2013108039@njau.edu.cn

基金項目：江蘇省科技計劃項目（BE2010385）

收稿日期：2014-07-08