刁依娜　蔣學(xué)華　鄧璐霞　羅林

(1. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041； 2. 四川科倫藥業(yè)股份有限公司，四川 成都 610051；3. 四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心口腔醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610041)

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胡椒堿-阿霉素復(fù)合物合成及抗腫瘤研究*

刁依娜1,2蔣學(xué)華1鄧璐霞2羅林3

(1. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041； 2. 四川科倫藥業(yè)股份有限公司，四川 成都 610051；3. 四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心口腔醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610041)

【摘要】目的合成胡椒堿-阿霉素復(fù)合物，并探討其抗腫瘤活性。方法將胡椒堿-阿霉素復(fù)合物制備成納米混懸體凍干制劑，體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，用MTT法考察胡椒堿-阿霉素復(fù)合物納米混懸液凍干制劑對(duì)HEPG-2細(xì)胞株、SMMC-7721/ADM細(xì)胞株、MCF-7/ADM細(xì)胞株、A549細(xì)胞株、B16細(xì)胞株、Hela細(xì)胞株、K562細(xì)胞株的抑制作用，并繪制抑制率-藥物濃度曲線。結(jié)果對(duì)7種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，且抑制作用比阿霉素組更強(qiáng)。結(jié)論胡椒堿-阿霉素復(fù)合物對(duì)HEPG-2細(xì)胞株、SMMC-7721/ADM細(xì)胞株、MCF-7/ADM細(xì)胞株、A549細(xì)胞株、B16細(xì)胞株、Hela細(xì)胞株和K562細(xì)胞株生長(zhǎng)有抑制作用，且抑制效果好于阿霉素。

【關(guān)鍵詞】胡椒堿； 阿霉素； 腫瘤

阿霉素是蒽環(huán)類抗生素，從松鏈絲菌淺灰色變株中提取得到。60年代初被廣泛用于肺癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤、白血病等多種腫瘤的治療。但蒽環(huán)類抗生素均有心臟毒性，其中以阿霉素較為嚴(yán)重，1973年Lefrak[1，2]等人首次報(bào)道了阿霉素的心臟毒性，相較于阿霉素的骨髓抑制、消化道不良反應(yīng)和腎臟毒性，心臟毒性對(duì)人體的危害更為嚴(yán)重，從而限制了阿霉素的臨床應(yīng)用。其同類藥物吡柔比星和表阿霉素，心臟毒性較阿霉素有所減輕，但仍無法完全避免。

胡椒堿是桂皮酞胺類生物堿，經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)其在抗腫瘤、抗胃潰瘍、降血脂、抗氧化、抗腦血管痙攣、促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞黑素的合成、保護(hù)心臟等多個(gè)領(lǐng)域均有不同程度的藥理活性[2，3]。同時(shí)，在體外研究或動(dòng)物研究中，還可將胡椒堿及其衍生物與多種藥物聯(lián)用，具有脊髓保護(hù)、抗抑郁、抗疲勞等藥理作用[4~6]。本研究旨在制備胡椒堿-阿霉素復(fù)合物納米混懸液凍干制劑(BPA)，并考察BPA在體外初步的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)效果。

1材料與方法

1.1藥品試劑、儀器與細(xì)胞株①藥品試劑：RPIM 1640、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液；磷酸緩沖液；二甲基亞砜(DMSO)；MTT溶液；96孔培養(yǎng)板；戊二烯酸鈉鹽；阿霉素；胡椒酸酰胺化阿霉素。②儀器：EYELAFDU-1200真空冷凍干燥儀(日本EYELA公司)；生物倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司XDS-1B)；CO2氣瓶(北京華宇辰氣體有限公司)；CO2減壓器(上海三友儀器廠)；pH計(jì)(葡萄牙HANNApH211)；XYJ-802型離心沉淀機(jī)(江蘇醫(yī)療儀器廠)。③細(xì)胞株與動(dòng)物：HEPG-2：人肝癌上皮細(xì)胞株；SMMC-7721/ADM：人肝癌上皮細(xì)胞阿霉素耐藥株；MCF-7/ADM：人乳腺癌上皮細(xì)胞阿霉素耐藥株；A549：人肺腺癌上皮細(xì)胞株；B16：人黑色素瘤細(xì)胞株；Hela：人宮頸癌上皮細(xì)胞株；K562：人白血病細(xì)胞株。均購自ATCC細(xì)胞庫。

1.2方法

1.2.1化合物的合成①(2E,4E)-5-(1,3-苯并二氧戊環(huán)-5-基)-2,4-戊二烯酸(BP)的合成：500ml三口瓶，磁力攪拌，回流冷凝，室溫下加入胡椒堿1 5.7g(20mmol)(外購，含量：99%)，加入無水甲醇200ml，完全溶解后加入氫氧化鈉1.7g (40mmol)(科龍化工，含量：96%)，然后升溫至回流反應(yīng)5h，TLC檢測(cè)(展開劑：乙酸乙酯∶石油醚=1∶5)反應(yīng)體系，原料1反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫后2N鹽酸調(diào)節(jié)pH=2，冰浴下緩慢重結(jié)晶，過濾，干燥，得到產(chǎn)品為淡黃色粉末2 3.6g。HPLC檢測(cè)含量99%，收率82%。HPLC-MS測(cè)定分子量M+218.3。②(2E,4E)-5-(1,3-苯并二氧戊環(huán)-5-基)-2,4-戊二烯酸阿霉素復(fù)合物(BPA)的合成：100ml三口瓶，磁力攪拌，回流冷凝，加入氯化鈣干燥管，室溫下加入BP 50mg(0.22mmol)，加入溶劑THF 10ml，完全溶解后加入羧基活化劑N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)30mg(0.24mmol)，完全溶解后冰浴冷卻到0℃，滴入N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)50mg(0.24mmol)的DMF溶液5mL，該溫度下反應(yīng)1h，TLC檢測(cè)(展開劑：甲醇∶乙酸乙酯=1∶2)反應(yīng)體系，BP反應(yīng)完畢后，滴加116mg(0.2mmol)鹽酸阿霉素的DMF-三乙胺溶液6ml，滴加完畢后體系變?yōu)樯钛t色液體，然后控制溫度室溫反應(yīng)12h，HPLC監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完畢后減壓蒸餾除去溶劑THF，得到深紅色溶液，加入乙酸乙酯和適量水，萃取，水洗，乙酸乙酯用稀酸洗滌三次，無水硫酸鈉干燥，濃縮得到粗品。粗品進(jìn)行柱層析純化，洗脫劑：乙酸乙酯∶甲醇=2∶1，收集得到純品，濃縮后得到深紅色固體4 75mg。HPLC檢測(cè)含量97%，收率48%。HPLC-MS測(cè)定分子量M+743.8。BPA的合成過程，見圖1。

1.2.2BPA納米混懸液凍干制劑的制備稱取0.5g BPA，F(xiàn)6 80.2g，加入50ml蒸餾水中，高剪切混合乳化機(jī)分散1min，加入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)。均質(zhì)條件：壓力1000bar均質(zhì)5次，壓力2000bar均質(zhì)20次。將均質(zhì)后樣品中加入適量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑甘露醇，分裝后于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。最后滅菌即得成品。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn)方法收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μl。鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。5% CO2，37℃孵育12h，將細(xì)胞分為四組(空白對(duì)照組，ADM組，BP鈉鹽組，BPA)。BP鈉鹽組：(2E,4E)-5-(1,3-苯并二氧戊環(huán)-5-基)-2,4-戊二烯酸鈉；BPA組：(2E,4E)-5-(1,3-苯并二氧戊環(huán)-5-基)-2,4-戊二烯酸阿霉素復(fù)合；ADM組：鹽酸阿霉素。ADM組：加入濃度梯度(0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/mL)的ADM；BP鈉鹽組：加入濃度梯度的ADM(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0μg/ml)，另外加入濃度梯度的BP鈉鹽(5μmol/L，15μmol/L，25μmol/L，50μmol/L)；BPA組：加入濃度梯度的BPA(0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/ml)。設(shè)3個(gè)復(fù)孔。然后在5% CO2，37℃條件下孵育48h。每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD=490nm處測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率：

圖1胡椒堿-阿霉素復(fù)合物的合成過程

Figure 1The synthesis of piperine-doxorubicin complex

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HEPG-2細(xì)胞株的MTT結(jié)果：BPA組與BP鈉鹽組50抑制率相當(dāng)，且優(yōu)于其他組(見圖2)；SMMC-7721/ADM細(xì)胞株的MTT結(jié)果：BPA組的抑制率優(yōu)于其他組(見圖3)；MCF-7/ADM細(xì)胞株的MTT結(jié)果：BPA組與BP鈉鹽組50抑制率相當(dāng)，且優(yōu)于其他組(見圖4)；A549細(xì)胞株的MTT結(jié)果，BP鈉鹽組50的抑制率略優(yōu)于BPA組，但上述兩組的抑制率均優(yōu)于其他組(見圖5)；B16細(xì)胞株的MTT結(jié)果：BPA組的抑制率優(yōu)于其他組(見圖6)；Hela細(xì)胞株的MTT結(jié)果：BP鈉鹽組50的抑制率優(yōu)于其他組(見圖7)；K562細(xì)胞株的MTT結(jié)果：BPA組與BP鈉鹽組50抑制率相當(dāng)，且優(yōu)于其他組(見圖8)。

從各種細(xì)胞的抑制率比較結(jié)果，加入BP鈉鹽的各組抑制率與ADM組比較均有明顯的提高，且BP鈉鹽的濃度達(dá)到50μmol/L的時(shí)候，抑制效果最為明顯，BPA組的抑制效果較ADM組也有明顯的提高，且抑制水平同BP鈉鹽濃度達(dá)到50μmol/L的時(shí)候，抑制效果相當(dāng)。

圖2 HEPG-2 MTT 檢測(cè)結(jié)果

Figure 2MTT test results of HEPG-2

圖3SMMC-7721/ADM MTT 檢測(cè)結(jié)果

Figure 3　MTT test results of SMMC-7721/ADM

圖5A549 MTT 檢測(cè)結(jié)果

Figure 5　MTT test results of A549

圖7Hela MTT 檢測(cè)結(jié)果

Figure 7MTT test results of Hela

圖8K562 MTT 檢測(cè)結(jié)果

Figure 8MTT Test Results of K562

3討論

阿霉素是臨床上常用的一種抗腫瘤抗生素，抗瘤譜較廣，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用，屬周期非特異性藥物。阿霉素可以抑制RNA和DNA合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)。胡椒堿是桂皮酞胺類生物堿，為胡椒的主要活性成分，存在于多種植物中，但在胡椒科植物中含量最高。目前有關(guān)胡椒堿的抗腫瘤藥理研究有很多報(bào)道，已有文獻(xiàn)報(bào)道將胡椒堿及其衍生物同多種藥物聯(lián)合用于抗抑郁、脊髓保護(hù)、抗疲勞等多個(gè)治療領(lǐng)域[7~10]。

中藥一直在臨床治療中占據(jù)著重要地位，在臨床上越來越多的腫瘤患者在接受化療的同時(shí)再服用中藥，作為一種替代補(bǔ)充治療的手段。據(jù)統(tǒng)計(jì)，腫瘤病人是服用中藥最多的人群。有調(diào)查表明1990年全球約31.4%的腫瘤患者在接受放化療同時(shí)使用中藥，并且還有增加的趨勢(shì)。但是中藥也有其局限性，體外研究和臨床觀察表明中草藥會(huì)和許多化學(xué)藥物發(fā)生相互作用，而這種相互作用主要是由于中藥中的活性成分會(huì)對(duì)人體內(nèi)的各種藥物代謝酶和/或轉(zhuǎn)運(yùn)體有影響。如果兩者合用得當(dāng)則可以發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)生協(xié)同作用以提高藥物療效。但是如果合用不當(dāng)，則會(huì)降低療效甚至產(chǎn)生或增加毒副作用[7,8]。

本研究通過合成胡椒堿-阿霉素復(fù)合物，并將其制備成納米混懸液凍干制劑，考察它對(duì)EPG-2細(xì)胞株、SMMC-7721/ADM細(xì)胞株、MCF-7/ADM細(xì)胞株、A549細(xì)胞株、B16細(xì)胞株、Hela細(xì)胞株和K562細(xì)胞株的抑制作用。結(jié)果顯示胡椒堿-阿霉素復(fù)合物對(duì)上述7種細(xì)胞株的生長(zhǎng)均有抑制活性，并且抑制活性高于鹽酸阿霉素組。表明胡椒堿-阿霉素復(fù)合物可以提高阿霉素的療效。這種將中藥材的主要活性物質(zhì)通過化學(xué)合成方法與化學(xué)藥制成復(fù)合物，為中西藥合用提供了一種新的研究思路，但是其作用機(jī)制、安全性等目前尚未明確，有待進(jìn)一步的研究深入探討。

4結(jié)論

本研究提示，將胡椒堿與阿霉素聯(lián)合使用與阿霉素單用相比提高了抗腫瘤活性，胡椒堿-阿霉素復(fù)合物對(duì)研究中所選腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出抑制作用，為胡椒堿與其他藥物聯(lián)用提供了初步的證據(jù)，也為中西藥合用提供了新的研究思路。

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Study on the synthesis of piperine-doxorubicin complex and its anti-tumor activities

DIAO Yi-na1,2, JIANG Xue-hua1, DENG Lu-xia2,etal

(1.WestChinaSchoolofPharmacy,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;2.SichuanKelunPharmaceuticalCo.Ltd.,Chengdu610051,China)

【Abstract】ObjectiveTo research the anti-tumor activity of synthetize piperine and doxorubicin. Methods HEPG-2 cell strain, SMMC-7721/ADM cell strain, MCF-7/ADM cell strain, A549 cell strain, B16 cell strain, Hela cell strain and K562 cell strain were cultured in vitro. The inhibitory action of lyophilized preparation of piperine-doxorubicin complex on tumor was evaluated with MTT. The inhibition ratio-drug concentration curve was made.ResultsPiperine-doxorubicin complex had inhibitory action to the 7 tumor cells and the inhibiting effect was better than doxorubicin. ConclusionPiperine-doxorubicin complex has inhibitory action to HEPG-2 cell strain, SMMC-7721/ADM cell strain, MCF-7/ADM cell strain, A549 cell strain, B16 cell strain, Hela cell strain and K562 cell strain, and the inhibiting effect is better than doxorubicin.

【Key words】Piperine; Doxorubicin; Tumor

(收稿日期：2014-08-01； 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：蔣學(xué)華，E-mail:jxh1013@scu.edu.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30972764/H1005)

【中圖分類號(hào)】R 979.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.01.040