李應(yīng)宏　莫燁　李勁梅　闕玉梅　張玲

(1.攀枝花市攀鋼集團(tuán)總醫(yī)院，四川 攀枝花 617023；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 四川 成都 610041)

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耐藥性癲癇患者腦內(nèi)Nurr1基因及蛋白產(chǎn)物的表達(dá)*

李應(yīng)宏1莫燁1李勁梅2闕玉梅1張玲1

(1.攀枝花市攀鋼集團(tuán)總醫(yī)院，四川 攀枝花 617023；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 四川 成都 610041)

【摘要】目的研究耐藥性癲癇患者顳葉和海馬組織中Nurr1基因及其蛋白產(chǎn)物的表達(dá),探討其在耐藥性癲癇形成中的作用。方法用RT-PCR和免疫組化聯(lián)合檢測(cè)40例耐藥性癲癇患者(實(shí)驗(yàn)組)腦組織中Nurr1基因及蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，并與11例對(duì)照組比較。結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示Nurr1 mRNA水平在耐藥性癲癇患者腦組織中表達(dá)較對(duì)照組增高，Nurr1/ GAPDH(內(nèi)參基因)灰度值在耐藥性癲癇患者腦組織中為6.18，對(duì)照組為2.39(P<0.05)。免疫組化與RT-PCR結(jié)果一致，顯示耐藥性癲癇顳葉和海馬Nurr1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組 (P<0.05)。結(jié)論Nurr1基因及其蛋白產(chǎn)物在耐藥性癲癇患者腦內(nèi)表達(dá)明顯增加,提示其可能參與了耐藥性癲癇的發(fā)生與發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】Nurr1基因; 苔蘚纖維; 難治性癲癇

神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)重組和興奮性突觸環(huán)路形成是耐藥性癲癇最為重要的病理特征，而苔蘚纖維發(fā)芽則是其形成的病理基礎(chǔ)，研究與異常芽生的相關(guān)因素,進(jìn)而尋求其改進(jìn)的方法有可能為耐藥性癲癇的治療開辟新的途徑。為此,我們利用熒光定量PCR(Fluorescence quantitation real time polymerase chain reaction,FQ-rtPCR),免疫組化和免疫熒光法研究了與苔蘚纖維芽生密切相關(guān)的Nurr1基因在耐藥性癲癇患者顳葉中的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料和方法

1.1臨床資料實(shí)驗(yàn)組40例耐藥性癲癇病人系2011年12月~2013年12月在華西醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)治療者。所有病人均符合以下條件：①有癲癇發(fā)作的典型表現(xiàn)和腦電圖特征，正規(guī)服用二種或二種以上一線抗癲癇藥(卡馬西平、丙戊酸、苯妥英鈉)治療2年以上，血藥濃度在正常高限，與發(fā)作前基線比較，發(fā)作頻率沒有明顯減少。②無明顯病因可尋，神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查沒有局灶性神經(jīng)系統(tǒng)體征或雖有體征但與癲癇發(fā)作無關(guān)，術(shù)后腦組織檢查沒有發(fā)現(xiàn)能引起癲癇發(fā)作的病因。③病人的發(fā)作類型符合國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟1981年有關(guān)癲癇發(fā)作類型分類的規(guī)定。④頭部CT或核磁共振檢查除海馬硬化外，未發(fā)現(xiàn)占位性病變或其他能解釋癲癇發(fā)作的疾病。⑤術(shù)前均經(jīng)24h腦電圖或視頻腦電圖(Vedio electrocorticography VEEG)或術(shù)前1周放置硬膜下電極，并結(jié)合CT或MRI定位致癇灶。⑥術(shù)中均用皮質(zhì)電極(ECoG)監(jiān)測(cè)，術(shù)后在切除的邊緣再次放置ECoG確保致癇灶完整切除。⑦病人及其家屬術(shù)前均簽知情同意書。40例難治性癲癇臨床資料見表1。對(duì)照組11例系成都市因意外死亡或非自然死亡后按法律規(guī)定需進(jìn)行尸解的人，符合下列條件: ①無中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史。②病理切片證實(shí)腦組織結(jié)構(gòu)基本正常。③取材部位為海馬和顳葉，死亡時(shí)間與取材時(shí)間<6小時(shí)。④家屬同意,并簽注知情同意書。對(duì)照組11例臨床特征見表2。

表1　實(shí)驗(yàn)組40例難治性癲癇患者的臨床特征

注：CPS：復(fù)雜部分性發(fā)作(Complex Partial Seizure); SGS：部分性發(fā)作繼發(fā)全身性發(fā)作(Secondarily Generalized Seizure); TS：強(qiáng)直性發(fā)作(Tonic Seizure); MT：多種類型發(fā)作(Multiple Type) 強(qiáng)直-陣攣性、強(qiáng)直性、陣攣性，復(fù)雜部分性、單純部分發(fā)作; TN：顳葉皮質(zhì)(Temporal Neocortex); H：海馬(hippocampi); L：左側(cè)(left); R：右側(cè)(right); nl：神經(jīng)元丟失(neurons loss); g：膠質(zhì)細(xì)胞增生(gliosis); nd：神經(jīng)元變性 (neurons degeneration); ac：星型膠質(zhì)細(xì)胞增生(astrocytosis); a：萎縮(atrophy); nad：無異常發(fā)現(xiàn)(no abnormal finding)

表2　對(duì)照組11例患者臨床特征

注：TN：顳葉皮質(zhì)(Temporal Neocortex); H：海馬(hippocampi); L：左側(cè)(left); R：右側(cè)(right)

1.2實(shí)驗(yàn)方法術(shù)中獲取實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本，標(biāo)本取出后，立即用已編號(hào)并浸泡于DEPC液24小時(shí)以上的錫紙包裹后置于液氮中冷凍保存，部分置于4%多聚甲醛固定48小時(shí)后常規(guī)石蠟包埋，備用。對(duì)照組處理方法同上。

1.2.1伊紅染色和芽生標(biāo)記物GAP43的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組石臘標(biāo)本行連續(xù)冠狀切片，片厚4μm，行常規(guī)的伊紅染色，光鏡下觀察病理改變。用免疫熒光法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組中芽生標(biāo)記物GAP43，具體操作步驟如后所述，一抗滴度1∶100(Rabbit against human, Santa Cruz,USA),二抗滴度1:200(Fitc標(biāo)記山羊抗兔，北京中杉生物公司)

1.2.2總mRNA的提取RNA制備及質(zhì)檢:細(xì)胞總mRNA采用UNIzol 試劑(Boistar公司)，按操作說明書抽提，提取的總RNA樣本保存在加入了RNase-free的Mikki-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃冰箱保存。用紫外分光光度儀、電泳、水浴試驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)檢，合格后采用mRNA柱純化試劑盒(Boistar公司)純化個(gè)體樣品的 mRNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

1.2.3RT-PCR對(duì)質(zhì)檢合格的樣品mRNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值，合格后，分別取5μg mRNA為逆轉(zhuǎn)錄模板。根據(jù)rt-PCR引物設(shè)計(jì)原則，Primer express1.5軟件設(shè)計(jì)前導(dǎo)鏈5′-GCACTTCGGCAGAGTTGAAT-3′，后隨鏈為5′-TGGACAGTGTCGTAATTCAA-3′，GAPDH為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系置于Corbet Research公司的Rotor Gene 3,000 PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。樣品按下列條件擴(kuò)增：94℃ 2 min預(yù)變性，然后94℃ 30 sec，61℃ 30 sec，72℃ 30 sec共40個(gè)循環(huán), 72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)RT-PCR產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)染色采用ABC法，按試劑盒說明書操作，加入兔抗人抗體Nurr1(SATA CRUZ公司)，滴度1∶100，4 ℃過夜，加入生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色(北京中杉生物公司)，蘇木素復(fù)染，分色，梯度酒精脫水，常規(guī)封片。采用YC-FY-2050型病理采集系統(tǒng)分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組切片行圖像采集，每張切片隨機(jī)選4個(gè)視野，北航CM-2000B型生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)光密度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOV)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)比較時(shí)若方差齊用t檢驗(yàn)，方差不齊用t′檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1常規(guī)病理檢查和芽生標(biāo)記物GAP43標(biāo)記HE染色常規(guī)病理檢查顯示癲癇患者顳葉腦組織中有不同程度的神經(jīng)元丟失、變性，膠質(zhì)細(xì)胞增生和軸突斷裂(見圖1)。實(shí)驗(yàn)組顳葉皮質(zhì)和海馬均可見芽生標(biāo)記物GAP43的陽(yáng)性著色，而對(duì)照組未見GAP43陽(yáng)性表達(dá)(見圖2)。

2.2RT-PCR結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示，正常腦組織中Nurr1mRNA灰度值/ GAPDH灰度值的比值為2.39，耐藥性癲癇腦組織灰度值/ GAPDH灰度值的比值為6.18 (見圖3)。

Table 3Comparison of Nurr1 optical density between the experimental group and the control group

海馬區(qū)域?qū)嶒?yàn)組對(duì)照組tP錐體細(xì)胞層0.2038±0.04020.035±0.03627.850.0000CA1區(qū)0.1702±0.03030.0117±0.021511.930.0000CA3區(qū)0.195±0.03670.015±0.018710.690.0000齒狀回區(qū)0.2083±0.04580.0117±0.007510.380.0000

圖1HE染色結(jié)果

Figure 1HE stain of RE group and control group

注：a：HE染色的耐藥性癲癇組海馬;b：HE染色的對(duì)照組海馬；圖中a、b標(biāo)尺均為100μm.光鏡下觀察可見耐藥性癲癇組神經(jīng)元較對(duì)照組神經(jīng)元排列結(jié)構(gòu)紊亂.部分神經(jīng)元變性、壞死

圖2芽生標(biāo)記物GAP43的檢測(cè)

Figure 2GAP43 immunolabelling

注：難治性癲癇組顳葉和海馬神經(jīng)細(xì)胞體和軸突均可見GAP43陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞。對(duì)照組則未見GAP43陽(yáng)性著色細(xì)胞。a：癲癇組顳葉皮質(zhì)；b：癲癇組海馬；c：對(duì)照組顳葉皮質(zhì)；d：對(duì)照組海馬；a、c標(biāo)尺75 μm；b、d標(biāo)尺37.5 μm

圖3Nurr1基因的rt-PCR電泳圖

Figure 3rt-PCR result of Nurr1

注：C：為對(duì)照組；RE：為耐藥性癲癇組；內(nèi)參設(shè)置為GADPH，耐藥性癲癇組Nurr1的mRNA擴(kuò)增條帶明顯寬于對(duì)照組

圖4免疫組化結(jié)果

Figure 4Immunohistochemistry results

注：結(jié)果顯示Nurr1蛋白質(zhì)在耐藥性癲癇顳葉和海馬中較對(duì)照組均明顯升高。a：耐藥性癲癇顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元；b：對(duì)照組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元；c：顳葉膠質(zhì)細(xì)胞；d：對(duì)照組膠質(zhì)細(xì)胞；e：耐藥性癲癇海馬錐體細(xì)胞；f：對(duì)照組海馬錐體細(xì)胞；g：耐藥性癲癇海馬CA3區(qū)顆粒細(xì)胞；h：對(duì)照組海馬CA3區(qū)顆粒細(xì)胞；i：大鼠中腦神經(jīng)元陽(yáng)性對(duì)照；j：陰性對(duì)照

3討論

約70%的癲癇患者經(jīng)正規(guī)藥物治療后能有效控制發(fā)作，但仍有30%左右的患者對(duì)傳統(tǒng)的一線抗癲癇藥耐藥，稱為耐藥性癲癇。耐藥性癲癇治療困難的原因很多，但最重要的是對(duì)其發(fā)病機(jī)制不了解,無法根據(jù)發(fā)病的中心環(huán)節(jié)來開發(fā)新的藥物,尋求新的治療途徑。研究耐藥性癲癇形成的相關(guān)因素,有可能為改善目前治療上的被動(dòng)局面提供新的思路。神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)重組和興奮性突觸環(huán)路形成是耐藥性癲癇主要的病理特征，而苔蘚纖維芽生則在其中起著重要作用。研究芽生的相關(guān)因素有可能為揭示耐藥性癲癇發(fā)生發(fā)展提供重要線索。

Nurr1基因?qū)儆诤耸荏w超家族的孤兒受體。1992年由Law[1]首次在鼠腦內(nèi)克隆出。該基因位于2q22-23，具有獨(dú)特的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，可與DNA以單體或異二聚體聯(lián)結(jié)以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[2-3]。分布于黑質(zhì)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)的Nurr1與腦內(nèi)多巴胺(Dopamine, DA)神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)，對(duì)DA能神經(jīng)元的發(fā)育、生存和功能的維持起著重要的作用[4],而海馬和腦皮質(zhì)中的Nurr1功能則與DA無關(guān)[5]。海馬中Nurr1 mRNA在腦發(fā)育初期高水平表達(dá)，腦發(fā)育成熟后水平明顯下降[1]。

異常芽生引起顳葉，尤其是海馬通路的結(jié)構(gòu)和興奮性改變已在癲癇動(dòng)物模型中得到證實(shí)[6]，盡管這種改變的分子機(jī)制至今尚不清楚，但即早基因可能在其中起著重要作用，敲除此基因的小鼠點(diǎn)燃后沒有明顯芽生存在[7]，而此基因的突變鼠除有癲癇發(fā)作外，還有明顯的苔蘚纖維芽生[8]。即早基因誘發(fā)苔蘚纖維芽生可能與它們編碼的轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)依賴神經(jīng)元活動(dòng)的基因級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)有關(guān), 在激活一系列后效應(yīng)基因(late-effector genes)的轉(zhuǎn)錄后，激活酶，神經(jīng)肽，受體，離子通道，結(jié)構(gòu)蛋白，生長(zhǎng)因子等基因都明顯表達(dá)上調(diào)，從而引起持續(xù)性生化效益，導(dǎo)致神經(jīng)元突觸重塑，即早基因引起的這種神經(jīng)元突觸重塑與癲癇灶的形成發(fā)展密切相關(guān)[9]。Nurr1作為唯一的由即早基因編碼的核受體蛋白，在細(xì)胞信號(hào)傳遞中起著核心作用[10]。

本文在檢測(cè)到芽生標(biāo)記物GAP43的耐藥性癲癇組中發(fā)現(xiàn)，Nurr1在顳葉皮質(zhì)和海馬中的表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)，提示Nurr1參與了耐藥性癲癇的形成。作為芽生早期“分子開關(guān)”，Nurr1的持續(xù)表達(dá)上調(diào)有可能是癲癇芽生的早期標(biāo)記物，改變其表達(dá),有可能成為新藥開發(fā)的一個(gè)新靶點(diǎn)。

Nurr1表達(dá)還受神經(jīng)細(xì)胞膜去極化或癇性發(fā)作的影響，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，海人藻酸誘導(dǎo)的癲癇模型中Nurr1可在海馬的CA1，CA3和顳葉皮質(zhì)中持續(xù)升高[11]。Nurr1直接或與其它即早基因相互作用共同調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)依賴性基因如生長(zhǎng)因子及其受體，突觸和軸突蛋白等效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄在突觸重塑方面發(fā)揮作用[5]。Nurr1還可影響突觸前膜囊泡代謝基因KA2的轉(zhuǎn)錄，后者是谷氨酸受體亞單位，與突觸間神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和神經(jīng)分化有關(guān)[12]。最近的研究已發(fā)現(xiàn)突觸功能異?？赡茉谀退幮园d癇的形成中起著重要作用[13]。Nurr1和其它即早基因一樣，受癲癇活動(dòng)的調(diào)節(jié)并使其電活動(dòng)持續(xù)升高，導(dǎo)致局部神經(jīng)元的持續(xù)性興奮和長(zhǎng)時(shí)程電位的強(qiáng)化[14]。而突觸的長(zhǎng)時(shí)程電位持續(xù)10天即可誘發(fā)明顯的芽生[15],導(dǎo)致突觸功能和結(jié)構(gòu)改變,進(jìn)行促進(jìn)頑固性癇灶形成。

4結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，Nurr1基因及其蛋白產(chǎn)物在耐藥性癲癇患者腦內(nèi)表達(dá)明顯增加,提示其可能參與了耐藥性癲癇的發(fā)生與發(fā)展。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Law SW, Conneely OM, DeMayo FJ,etal. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1[J]. Mol Endocrinol, 1992,6(12):2129-2135.

[2]Wang Z, Benoit G, Liu J，etal. Structure and function of Nurr1 identifies a class of ligand-independent nuclear receptors[J]. Nature, 2003,423(6939):555-560.

[3]Xiao Q, Castillo SO, Nikodem VM. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization[J]. Neuroscience,1996,75(1):221-230.

[4]Wallen A, Castro DS, Zetterstrom RH,etal. Orphan nuclear receptor Nurr1 is essential for ret expression in midbrain dopamine neurons and in the brain stem[J]. Mol Cell Neurosci,2001,18(6):649-663.

[5]Crispino M, Tocco G, Feldman JD,etal. Nurr1 mRNA expression in neonatal and adult rat brain following kainic acid-induced seizure activity[J].Brain Res Mol Brain Res,1998,59(2):178-188.

[6]Maru E, Kanda M, Ashida H. Functional and morphological changes in the hippocampal neuronal circuits associated with epileptic seizures[J].Epilepsia,2002,43(9):44-49.

[7]Zheng D, Butler LS, McNamara JO. Kindling and associated mossy fibre sprouting are not affected in mice deficient of NGFI-A/NGFI-B genes[J]. Neuroscience, 1998,83(1):251-258.

[8]Nahm WK, Noebels JL. Nonobligate role of early or sustained expression of immediate early gene proteins c-Fos,c-Jun, and Zif/268 in hippocampal mossy fiber sprouting[L].J Neurosci,1998,18(22):9245-9255.

[9]Murashima YL, Suzuki J, Yoshii M. Developmental program of epileptogenesis in the brain of EL mice[J].Epilepsia,2005,46(5):10-16.

[10] Zetterstrom RH, Williams R, Perlmann T,etal. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system[J]. Brain Res Mol Brain Res, 1996,41(1-2):111-120.

[11] Honkaniemi J, Sharp FR. Prolonged expression of zinc finger immediate-early gene mRNA and decreased protein synthesis following kainic acid induced seizures[J]. Eur J Neurosci,1999,11(1):10-17.

[12] Chew LJ, Huang F, Boutin JM,etal. Identification of nuclear orphan receptors as regulators of expression of a neurotransmitter receptor gene[J]. J Biol Chem, 1999,274(41): 29366-29375.

[13] Landmark CJ. Targets for antiepileptic drugs in the synapse[J].Med Sci Monit， 2007，13(1)：1-7.

[14] Pena de Ortiz S, Cannon MM, Jamieson GA Jr. Expression of nuclear hormone receptors within the rat hippocampus: identification of novel orphan receptors[J].Brain Res Mol Brain Res,1994,23(3):278-283.

[15] Adams B, Lee M, Fahnestock M,etal.Long-term potentiation trains induce mossy fiber sprouting[J].Brain Res,1997,775(1-2):193-197.

The study of mRNA and protein level expression of Nurr1 in refractory epilepsy

LI Ying-hong，MO Ye， LI Jin-mei，etal

(GeneralHospitalofPangangGroup,Panzhihua617023,Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo learn Nurr1 mRNA and protein expressional levels in temporal lobe and hippocampus tissue of patients with refractory epilepsy and the role it plays in mossy sprouting. MethodsFQ- rtPCR, and immunohistochemistry were used to check Nurr1 mRNA and protein levels in refractory epilepsy, comparing to the 11 cases from control group. ResultsRt-PCR result showed Nurr1 mRNA level was up regulated in refractory epilepsy group. The gray scale ratio of Nurr1 and GADPH is 6.18 in refractory epilepsy and 2.39 in the control group (P<0.05). Immunohistochemistry showed the protein level of Nurr1 up-regulated obviously in refractory in epileptic temporal lobe, the optical density value is 0.2417±0.0426 in refractory epilepsy and 0.065±0.0524 in the control group(P<0.05), the similar result also got in hippocampus tissue. ConclusionThe function of Nurr1 is associated with mossy fiber sprouting closely, both Nurr1 mRNA and protein level up regulated in refractory epilepsy indicated it play an important role in mossy fiber sprouting process.

【Key words】Nurr1; Mossy fibers; AEDs resistant epilepsy

(收稿日期：2014-02-17； 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：李勁梅，E-mail: jinmeili-neuro@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81071047)

【中圖分類號(hào)】R 742.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.01.002