郝媛媛孫建軍，2

·實(shí)驗(yàn)研究·

兔聲帶注射脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和自體脂肪的實(shí)驗(yàn)研究

郝媛媛1孫建軍1，2

目的 探討自體脂肪和脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）聲帶填充的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 16只新西蘭兔建立單側(cè)聲帶麻痹模型后，隨機(jī)分為脂肪組（麻痹側(cè)聲帶注射自體脂肪）和ADM組（麻痹側(cè)聲帶注射ADM），每組8只。每組動(dòng)物于聲帶注射術(shù)后2、4、8和12周各取2只行纖維喉鏡檢查觀察聲帶形態(tài)變化后，處死動(dòng)物并取出全喉，沿喉軸位自室?guī)е谅曢T下連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色，高倍光學(xué)顯微鏡下觀察填充材料組織學(xué)改變，并使用autoCAD軟件進(jìn)行填充材料剩余體積估算。結(jié)果 兩組的聲帶填充材料剩余體積均隨時(shí)間逐漸縮小，縮小的速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。脂肪組自體脂肪注射術(shù)后2周可見(jiàn)成活的脂肪細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布，與周圍組織未形成較明顯分界，后成活的脂肪細(xì)胞逐漸減少，代之以纖維結(jié)締組織相連的多個(gè)大泡，四周存活少量的脂肪細(xì)胞；術(shù)后3月脂肪團(tuán)塊周圍被纖維結(jié)締組織包繞，形成明顯的包膜。ADM組術(shù)后2周微粒間可見(jiàn)成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入及新生血管形成，隨后成纖維細(xì)胞逐漸增多，術(shù)后3月植入的ADM團(tuán)塊仍可見(jiàn)基本輪廓，組織結(jié)構(gòu)較致密，但與周圍組織界限不明顯。結(jié)論 兔聲帶注射自體脂肪和ADM后的吸收速率無(wú)顯著差異，但ADM植入后組織相容性好，可逐漸被原有組織改建、替代，作為聲帶注射填充材料有較大的發(fā)展空間和臨床應(yīng)用價(jià)值。

聲帶麻痹； 聲帶注射； 自體脂肪； 脫細(xì)胞真皮基質(zhì)

聲帶填充注射喉成形術(shù)（injection laryngoplasty，IL）是臨床常用于治療聲帶萎縮、聲帶麻痹、聲帶瘢痕、聲帶溝以及環(huán)杓關(guān)節(jié)固定等疾病所致聲門閉合不全的有效手段之一，其原理系將自體組織材料、同種異體材料或人工生物材料通過(guò)局部注射方式，填充到聲帶組織不同層次或聲帶旁間隙，依其容積效應(yīng)糾正聲門閉合不全，不同程度復(fù)原聲帶振動(dòng)特性，改善發(fā)聲功能［1］。近年來(lái)生物材料的發(fā)展與優(yōu)化為臨床提供了更多的選擇，然而不同材料在組織重塑效果、作用持續(xù)時(shí)間、聲帶振動(dòng)特性以及安全性和并發(fā)癥等方面的差異使得不同材料作為聲帶填充物的選擇仍然存在爭(zhēng)議。

目前常用的聲帶填充材料中，自體脂肪組織作為一種安全、有效的材料在臨床得到了廣泛應(yīng)用；而根據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）用于聲帶注射已有十余年歷史，其材料來(lái)源、使用效果、安全性與穩(wěn)定性受到了肯定［2］，然而，對(duì)于自體脂肪和ADM的比較研究卻鮮有報(bào)道。為此，本研究擬通過(guò)建立喉返神經(jīng)損傷致聲帶麻痹動(dòng)物模型，觀察自體脂肪、ADM微粒植入聲帶后的存留時(shí)間、重塑特性及組織學(xué)改變，探討這兩種材料用于聲帶注射填充的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇健康成年新西蘭兔16只，雌雄不限，體重2.0～3.0 kg。實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)纖維喉鏡檢查，確定其聲帶形態(tài)及運(yùn)動(dòng)正常。16只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為脂肪組（麻痹側(cè)聲帶注射自體脂肪）和ADM組（麻痹側(cè)聲帶注射ADM），每組8只。

1.2 聲帶麻痹動(dòng)物模型制備 將速眠新Ⅱ號(hào)注射液和氯胺酮注射液1：1混合后，對(duì)兩組動(dòng)物行肌肉注射麻醉（0.35～0.45 ml／kg）。動(dòng)物麻醉固定后術(shù)區(qū)備皮、消毒，取頸部正中縱行切口，暴露甲狀腺，翻開(kāi)甲狀腺左葉，找到左側(cè)甲狀腺下動(dòng)脈原伴行于該血管的喉返神經(jīng)，切除1 cm喉返神經(jīng)，斷端局部筋膜包埋，縫合切口［3］。術(shù)后立即使用纖維喉鏡檢查，以左側(cè)聲帶隨呼吸節(jié)律無(wú)活動(dòng)、聲帶縮短呈弓形即為造模成功（圖1），觀察2周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 聲帶注射材料的制備及注射方法

1.3.1 自體脂肪制備 左側(cè)聲帶麻痹造模成功2周后，脂肪組動(dòng)物麻醉后，取腹部縱行切口，依次分離皮下、肌肉組織，打開(kāi)腹腔，切取2 cm×2 cm× 0.5 cm大網(wǎng)膜脂肪組織，將血管去除，置于生理鹽水中漂洗，然后用剪刀剪碎，將細(xì)顆粒糊狀的脂肪組織1 ml放入1 ml注射器中備用。

1.3.2 ADM注射材料制備 將同種異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)補(bǔ)片（由北京清源偉業(yè)生物組織工程科技有限公司提供）用物理方法切割成約100μm×100 μm×100μm微粒，每100 mg分裝入5 ml注射器內(nèi)，Co60輻照滅菌。將微粒狀A(yù)DM與溶媒（0.5%普魯卡因）按0.1 g：0.8 ml制備，放入1 ml注射器中備用。

1.3.3 聲帶注射填充方法 兩組動(dòng)物全身麻醉固定后，術(shù)區(qū)消毒，頸部縱行切開(kāi)，暴露甲狀軟骨，緊貼甲狀軟骨下緣中點(diǎn)向左2～5 mm處，斜上方向進(jìn)針，將針頭刺入聲門旁間隙，同時(shí)，經(jīng)口插入纖維喉鏡，直視下移動(dòng)針頭并置于聲帶突尖端的外側(cè)注射0.15 ml自體脂肪或ADM［4］。注射完畢動(dòng)物常規(guī)復(fù)蘇后正常飼養(yǎng)，觀察動(dòng)物進(jìn)食、呼吸等情況。

1.4 聲帶形態(tài)觀察 兩組動(dòng)物于聲帶注射填充術(shù)后第2、4、8、12周各取2只進(jìn)行纖維喉鏡檢查，觀察注射側(cè)聲帶的形態(tài)及運(yùn)動(dòng)。

1.5 光鏡下觀察及填充物體積評(píng)估 各組在上述各時(shí)間點(diǎn)完成纖維喉鏡檢查后，分別處死該2只動(dòng)物，取出全喉，置于10%福爾馬林液體中固定24小時(shí)。常規(guī)石碏包埋，沿喉軸位自室?guī)е谅曢T下全喉連續(xù)切片，每500μm切片1張，進(jìn)行HE染色。高倍光學(xué)顯微鏡下觀察填充物的細(xì)胞及微粒形態(tài)、填充物體積、是否發(fā)生異物反應(yīng)、與周圍組織關(guān)系等。參考Seong KK的方法，使用autoCAD軟件計(jì)算每張切片中注射材料的體積（圖2）。注射材料的體積按照下列公式估算，體積＝剩余面積／每張×切片張數(shù)×0.5 mm［3］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 注射側(cè)聲帶形態(tài) 自體脂肪與ADM微粒注射術(shù)后聲帶均未見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)。術(shù)后及2周均可見(jiàn)術(shù)側(cè)聲帶體積飽滿，術(shù)后4周后聲帶體積明顯縮小，脂肪組和ADM組術(shù)側(cè)聲帶體積縮小速度同步，術(shù)后12周兩組術(shù)側(cè)聲帶注射部位稍隆起，與健側(cè)對(duì)比差別不明顯（圖2、3）。

2.2 光鏡下觀察 脂肪組自體脂肪注射術(shù)后2周

在聲帶肌層可見(jiàn)填充物周圍伴有炎性反應(yīng)，可見(jiàn)成活的脂肪細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布，與周圍組織未形成較明顯分界，術(shù)后4周炎性反應(yīng)基本消失；術(shù)后8周，植入脂肪組織主要為多個(gè)囊腔，其間以纖維結(jié)締組織相連，夾雜少量存活的脂肪細(xì)胞；術(shù)后12周，存活的脂肪細(xì)胞進(jìn)一步減少，脂肪團(tuán)塊周圍被纖維結(jié)締組織包繞，形成明顯的包膜（圖4）。ADM組注射ADM術(shù)后2周，微粒間可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入及新生血管形成，并見(jiàn)炎性反應(yīng)；術(shù)后4周，炎性反應(yīng)基本消失，成纖維細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞核較大，并呈卵圓形，ADM微粒與重建后的基質(zhì)區(qū)別明顯；術(shù)后8周，成纖維細(xì)胞數(shù)量減少并且細(xì)胞核變小，ADM微粒較少，新生基質(zhì)排列緊密；術(shù)后12周，ADM微粒基本消失，局部被新生膠原代替，新生膠原排列致密、整齊，ADM團(tuán)塊可見(jiàn)基本輪廓，但與周圍組織界限不明顯；ADM植入后均未見(jiàn)異物巨細(xì)胞反應(yīng)（圖5）。

2.3 注射材料體積變化 兩組聲帶注射填充的材料體積均隨時(shí)間逐漸縮小，速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

圖1 聲帶麻痹模型制備前后聲帶形態(tài)

圖2 脂肪組左側(cè)聲帶自體脂肪注射后纖維喉鏡下聲帶形態(tài)

圖3 ADM組左側(cè)聲帶ADM微粒注射后纖維喉鏡下聲帶形態(tài)

圖4 脂肪組自體脂肪植入后聲帶組織光鏡觀察圖

圖5 ADM微粒植入后光鏡觀察圖

表1 兩組自體脂肪和ADM微粒聲帶注射后不同時(shí)間填充物體積比較（像素，±s）

表1 兩組自體脂肪和ADM微粒聲帶注射后不同時(shí)間填充物體積比較（像素，±s）

組別2周4周8周12周脂肪組3 036.412 2±158.308 8 2 160.803 2±66.539 7 1 528.875 6±134.494 5 1 214.2948±509.617 9 ADM組4 174.722 0±336.803 9 2 267.089 0±312.587 9 1 646.202 9±121.827 6 1 074.5765±144.215 2

3 討論

1911年Brunings首次提出應(yīng)用IL治療單側(cè)聲帶麻痹，但是受材料和當(dāng)時(shí)外科技術(shù)的限制并未得到廣泛應(yīng)用。隨著注射技術(shù)和新型材料的發(fā)展，IL的作用得到了重新認(rèn)識(shí)，其適用范圍也在逐漸拓展，新型生物材料的發(fā)展與優(yōu)化既為臨床提供了更多的選擇，但也使得對(duì)于何謂最佳材料的認(rèn)知普遍存在爭(zhēng)議。

自體脂肪組織無(wú)排斥反應(yīng)，能為聲帶提供良好的振動(dòng)特性且取材相對(duì)容易，是目前臨床應(yīng)用最廣泛的聲帶填充材料。Guven的研究顯示，自體脂肪IL術(shù)后患者聲門閉合、粘膜振動(dòng)、喉粘膜感知功能、整體嗓音評(píng)級(jí)、聲學(xué)和空氣動(dòng)力學(xué)評(píng)估均有不同程度提高，術(shù)后發(fā)聲也有改善；隨訪1年后所有患者的吞咽功能均有改善［5］。但是自體脂肪組織的應(yīng)用尚存在一些爭(zhēng)議，其中吸收率問(wèn)題尤為突出；與之相關(guān)的問(wèn)題是自體脂肪獲取方式、確定最初和最終填充物體積的方法影響吸收率的計(jì)算，因此，有關(guān)其實(shí)際的吸收率和持續(xù)存留時(shí)間各家報(bào)道不同，但是對(duì)于自體脂肪高吸收率均持一致觀點(diǎn)［6～8］。Laccourreye認(rèn)為自體脂肪聲帶注射雖然是有效和安全的手術(shù)方式，但是注射后的吸收量和效果的持續(xù)時(shí)間難以預(yù)測(cè)，與之相比喉成形術(shù)具有良好和穩(wěn)定的治療效果，因此一定程度上減少了自體脂肪聲帶注射的使用［］。

近年發(fā)展起來(lái)的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）系利用物理、化學(xué)、生物等方法將同種異體或異種組織進(jìn)行脫細(xì)胞、除抗原等處理，最終獲得具有弱免疫抗原性的生物材料，目前已在組織工程、器官修復(fù)和重建、整形美容等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［10］。ADM作為多種膠原與彈性蛋白的復(fù)合物，利于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管的再生，最終使材料與受體組織完全一體化。有關(guān)ADM膠原網(wǎng)架轉(zhuǎn)歸的研究發(fā)現(xiàn)，ADM并非停留于基質(zhì)狀態(tài)，而是隨應(yīng)用部位的不同被改建為適宜的局部組織［11］。Tan等［2］的一項(xiàng)10年回顧性研究顯示，ADM對(duì)促進(jìn)聲門閉合、保護(hù)氣道、改善患者發(fā)聲都有很好的作用；同時(shí)對(duì)患者創(chuàng)傷小，能減少實(shí)施永久性手術(shù)的概率，1年以上隨訪者中48%患者發(fā)聲仍較滿意。ADM具有存留時(shí)間長(zhǎng)、改善發(fā)聲效果好、生物相容性好、易注射、無(wú)創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)，短效和長(zhǎng)效聲帶注射填充都適用。

文中結(jié)果顯示，自體脂肪和ADM聲帶注射填充后均發(fā)生較快的吸收，兩者吸收速率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析自體脂肪的吸收原因，多與局部未能及時(shí)建立血供，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞壞死、吸收有關(guān)。ADM微粒無(wú)細(xì)胞成分，即使受區(qū)血供較差，也應(yīng)不易出現(xiàn)液化、吸收。然而，本研究中發(fā)現(xiàn)ADM聲帶注射后吸收也較快，考慮可能與使用的濃度和材料粒徑有關(guān)；Sclafani［12］的研究中發(fā)現(xiàn)，ADM微粒皮下注射較皮內(nèi)注射吸收明顯加快，以此推測(cè)可能是皮下疏松結(jié)締組織或?qū)е挛⒘８斓碾x散，微粒間距離擴(kuò)大加速了ADM的吸收，因此，增加ADM濃度或許可以減慢其吸收。目前，ADM注射的適宜濃度沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，臨床應(yīng)用中商品化的產(chǎn)品如Cymetra的配比是將330 mg ADM微粒加入1～2 ml的1%利多卡因［2，13］；其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道多在150～600 mg／ml之間［12，14］，但是關(guān)于不同濃度注射的對(duì)比未見(jiàn)報(bào)道。ADM粒徑大小影響其降解和注射，粒徑小于52μm的微粒，更易被宿主細(xì)胞吞噬降解，但粒徑過(guò)大則不易注射［12］。另外，局部肌肉收縮、植入物受壓也可能影響其吸收速率。

從文中結(jié)果看，兩種注射材料聲帶注射后組織學(xué)轉(zhuǎn)歸差異較大，自體脂肪組織隨時(shí)間推移，存活脂肪細(xì)胞逐漸減少，代之以被纖維結(jié)締組織連接的囊腔，12周時(shí)殘留脂肪細(xì)胞數(shù)量極少，并且周圍形成明顯包膜，組織學(xué)形態(tài)與周圍組織差別明顯；而ADM植入后，隨時(shí)間推移，成纖維細(xì)胞逐漸長(zhǎng)入ADM微粒間，并伴新生血管形成，未見(jiàn)異物巨細(xì)胞反應(yīng)，提示ADM組織相容性良好，在植入體內(nèi)成纖維細(xì)胞合成膠原纖維和基質(zhì)的同時(shí)ADM微粒自身降解，其與周圍組織界限不明顯。可見(jiàn)，ADM植入后的轉(zhuǎn)歸是逐漸被宿主原有組織改建、替代。此外，相對(duì)于自體脂肪組織，ADM注射創(chuàng)傷小、獲取方便（無(wú)供體取材創(chuàng)傷），并且局麻下也可實(shí)施操作，具有明顯優(yōu)勢(shì)。由此可見(jiàn)，ADM作為聲帶填充注射材料，未來(lái)有較大的拓展空間和臨床應(yīng)用價(jià)值。

ADM最初并非專為聲帶填充注射而設(shè)計(jì)，目前臨床上用于聲帶注射的ADM制品多是通過(guò)物理方法將其進(jìn)行微?；幚?，使其具備可注射性；與自體脂肪材料相比，注射ADM的填充的效果差異并不明顯，因此，對(duì)ADM材料制備的優(yōu)化策略，如：通過(guò)提高制作技術(shù)以延緩降解，或者進(jìn)一步明確適宜的粒徑、注射濃度及與其他材料復(fù)合使用，將是未來(lái)

此類材料研究的熱點(diǎn)與方向。

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3 Kwon SK，Song JJ，Cho CG.Polycaprolactone spheres and theromosensitive Pluronic F127 hydrogel for vocal fold augmentation：in vivo animal study for the treatment of unilateral vocal fold palsy［J］.Laryngoscope，2013，123：1694.

4 Mallur PS，Rosen CA.Office-based laryngeal injections［J］. Otolaryngol Clin North Am，2013，46：85.

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（2015-02-26收稿）

（本文編輯 周濤）

Experimental Study on Acellular Dermal Matrix and Autologous Fat lnjected into Rabbit Vocal Cords

Hao Yuanyuan，Sun Jianjun
（Navy Clinical College，Anhui Medical University，Beijing，100048，China）

Objective To evaluate the clinical application of autologous fat and acellular dermal matrix（ADM）in vocal fold medialization.Methods A total of 16 New Zealand white rabbits of both sexes were divided into two study groups（8 rabbits in each group），after unilateral recurrent laryngeal nerve section，autologous fat or ADM were injected into paralyzed vocal folds.Laryngoscopic exams were performed 2，4，8，and 12 weeks after implantation；then larynx specimens were sampled and serially sectioned in axial plane from the false vocal fold to the subglottis.After section was stained with HE，histologic behavior of the graft were evaluated by optical microscope，volume of remaining material were calculated by autoCAD software.Results The remaining volume of autologous fat and ADM reduced gradually，there were no statistically significant differences between the 2 groups.In 2 weeks，fat cells survival was mass distribution，as its necrosis and absorption，intraimplant resulted in a plurality of cavitation，encapsulated by fibrous connective，mixed with a little survival fat cells.In 12 weeks，obvious capsule formation surrounded lipoma composed of fiber connective tissue.In the ADM group，2 weeks after injection，intra-implant fibroblast activity and neovascularization was noted，later fibroblast infiltration increased gradually.In 12 weeks，the implantation maintaun the basic outline and have compact organizational structure，but not forming obvious boundaries with the surrounding tissue.Conclusion Comparing degree of absorption，there were no statistically sig nificant

Vocal cord paralysis； Vocal fold medialization； Autologous fat； Acellular dermal matrix

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.04.013

時(shí)間：2015-6-17 9：54

R767.6+2

A

1006-7299（2015）04-0386-05

1 安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院（北京 100048）； 2 海軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

郝媛媛，女，河南人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)檠哉Z(yǔ)疾病.

孫建軍（Email：jjsun@sina.com）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150617.0954.004.html

differences between autologous fat and ADM in the study，but histological outcome of ADM is closer to the original organization.In future，ADM optimization or combination with other materials，will have a larger development and clinical application value.