徐吉周爭李吉平

·實驗研究·

siRNA干擾NF-E2相關因子2對喉鱗狀細胞癌化療敏感性的影響*

徐吉1周爭1李吉平1

目的 探討小片段干擾RNA（siRNA）干擾NF-E2相關因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）對人喉癌Hep2細胞化療敏感性的影響及凋亡的差異。方法 體外培養(yǎng)人喉癌細胞系Hep2，設立實驗組和對照組，實驗組（Hep2／siRNA組）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染siRNA至Hep2細胞系，對照組（Hep2／siRNA-control組）轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒siRNA-control。經(jīng)Western Blot驗證其轉(zhuǎn)染效果后，采用CCK-8法檢測計算Hep2／siRNA與Hep2／siRNA-control經(jīng)不同濃度梯度順鉑（分別為1、2、4、8、16μg／ml）處理后的細胞增殖抑制率及IC50值。通過凋亡試劑盒分別染色Hep2／siRNA與Hep2／siRNA-control細胞系，采用流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡率。結(jié)果實驗組的Nrf2蛋白表達比對照組發(fā)生下調(diào)，經(jīng)不同濃度梯度順鉑處理24 h后，Hep2／siRNA細胞系增殖抑制率相對Hep2／siRNA-control逐漸升高，順鉑濃度為4μg／ml時，對照組細胞增殖率為35.55%±6.14%，而實驗組細胞增殖率為46.07%±5.21%，IC50值下調(diào)，細胞凋亡率由17.1%（對照組）升高至26.6%（實驗組）。結(jié)論 siRNA干擾Nrf2基因可增強Hep2細胞系對順鉑的敏感性。

喉癌； NF-E2相關因子2； 小片段干擾RNA； 化療敏感性； 順鉑

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見惡性腫瘤之一，其致病機理尚不明確。多數(shù)研究提示，喉癌的發(fā)生發(fā)展與吸煙關系密切［1］，喉癌患者中吸煙者占95%，且吸煙量和時間與喉癌發(fā)病呈正相關，而氧化應激與吸煙關系密切［2，3］，被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可影響化療藥物療效，減弱腫瘤化療效果［4］。NF-E2相關因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）作為重要轉(zhuǎn)錄因子，其介導的Nrf2-ARE通路是最重要的抗氧化信號通路之一，處于氧化應激的中心地位［5］，最新研究發(fā)現(xiàn)其組成性表達增高可促進腫瘤發(fā)生與腫瘤耐藥［6，7］。本研究擬通過觀察小片段干擾RNA（siRNA）干擾抑制人喉癌細胞Hep2細胞系中Nrf2基因的表達，探討其對化療藥物順鉑（CDDP）治療喉癌的敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細胞系：人喉癌上皮Hep2細胞株；主要試劑：胎牛血清FBS；RMPI1640培養(yǎng)基，opti-MEM培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；培養(yǎng)瓶、多細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；Western電泳儀購自美國Invitrogen公司；lipo2000轉(zhuǎn)染試劑、胰蛋白酶購自Invitrogen，Annexin V-FITC／PI細胞凋亡試劑購自凱基公司，質(zhì)粒siRNA、Hep／siRNA-control購自廣州瑞博生物公司，順鉑購自上海仁濟醫(yī)院藥劑科。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人喉癌細胞系Hep2用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在37℃、95%空氣飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并適時傳代。

1.2.1 細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hep2細胞接種于6孔板培養(yǎng)，每孔105個細胞，融合度70%～80%，制備下述溶液，溶液A：10μl siRNA質(zhì)粒溶于250μl雙無opti-MEM培養(yǎng)基；溶液B：5μl Lipofectamine 2000溶于250μl雙無opti-MEM培養(yǎng)基中，靜置5 min；溶液C：混勻溶液A和溶液B，室溫孵育15 min，將溶液C滴入六孔板中；4 h后更換常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)（實驗組）。同法轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒siRNA-control作為對照組（即Hep2／siRNA-control組）。Hep2組不作任何處理。

1.2.3 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效果 ①提取Hep2、Hep2／siRNA兩種細胞于EP管，加入0.5 ml裂解液并吹打，裂解30 min后離心機12 000轉(zhuǎn)離心10 min，吸取上清液備用；②制備分離膠與濃縮膠，取等量樣品蛋白加入1倍體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min；③每個樣品孔加入40μg處理好樣品，電泳濃縮膠40 V、30 min，分離膠110 V、70 min至溴酚藍抵達凝膠底邊；④將備好的轉(zhuǎn)移用海綿、濾紙、PAGE膠、PVDF膜按三明治結(jié)構(gòu)放入電泳槽，加入足量轉(zhuǎn)膜緩沖液，加蓋轉(zhuǎn)印90 min；⑤轉(zhuǎn)膜后用TBST洗PVDF膜，加入脫脂奶粉封閉1 h再次洗膜；⑥加入一抗，室溫孵育1 h后搖床上搖動，并再次TBST洗膜3次；⑦加入二抗雜交，同上一步孵育搖動并洗膜；⑧取膜加入發(fā)光試劑ECL在暗室膠片曝光顯影，并予凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，掃描制片。

1.2.4 CCK-8法檢測順鉑對轉(zhuǎn)染后Hep2細胞系增殖抑制的影響 順鉑的使用濃度結(jié)合血漿峰濃度（peak plasma concentration，PPC）及預實驗結(jié)果，采用4.0μg／ml。具體步驟為：收集對數(shù)生長周期的Hep2、Hep2／siRNA、Hep2／siRNA-control細胞，按每孔3×103細胞密度、每孔100μl種于96孔板；培養(yǎng)24 h后向培養(yǎng)板加入系列稀釋的順鉑（終濃度分別為1μg／ml、2μg／ml、4μg／ml、8μg／ml、16μg／ml），在培養(yǎng)箱中孵育24 h；每孔加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h，酶標儀在480 nm處測定其吸光值，計算細胞增殖抑制率及半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）。細胞增殖抑制率（%）＝（1-實驗組OD值／陰性對照組OD值）× 100%。運用Graphpad Prism 5.0軟件計算IC50值。

1.2.5 細胞凋亡分析檢測 采用熒光顯微鏡與流式細胞儀分別檢測細胞凋亡，步驟如下：PBS漂洗、胰酶消化后收集（1～5）×105細胞；加入500μl的Binding Buffer懸浮細胞，加入5μl Annexin VFITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide，混勻，室溫、避光、反應5～15 min；上述細胞懸液滴于蓋玻片上，給予DAPI染色，均勻覆蓋于熒光顯微鏡觀察并照片；打開校正流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex＝488 nm，發(fā)射波長Em＝530 nm。調(diào)節(jié)Annexin V -FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光（流式Ex＝488 nm，Em≥630 nm）通過FL3

通道檢測。熒光補償調(diào)節(jié)：使用經(jīng)凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。四象限中，右下象限表示早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞。通過流式細胞儀讀取凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計算各組抑制率的平均值（%），采用隨機區(qū)組設計方差分析不同濃度梯度CDDP作用下，Hep2組、Hep2／siRNA組及Hep2／siRNA-control組細胞的抑制率。

2 結(jié)果

2.1 Nrf2-siRNA的轉(zhuǎn)染效果 實驗組的Hep2／siRNA蛋白表達量明顯低于Hep2組（圖1）。

圖1 Nrf2-siRNA轉(zhuǎn)染前后Western Blot結(jié)果

2.2 不同濃度梯度CDDP處理Hep2、Hep2／siRNA、Hep2／siRNA-control三組細胞24 h后CCK -8檢測結(jié)果（表1） 由表1可見，Hep2組與Hep2／siRNA-control組細胞抑制率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Hep2／siRNA組細胞抑制率高于Hep2、Hep2／siRNA-control組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；隨CDDP藥物濃度增高，各組抑制率也逐漸提高，當CDDP濃度為4μg／ml時Hep2／siRNA的細胞抑制率明顯高于對照組（P＜0.05）。Hep2、Hep2／siRNA、Hep2／siRNA-control三組IC50分別為7.90、5.270、8.107μg／ml。

表1 不同濃度梯度CDDP作用下各組細胞的抑制率（%，±s）

表1 不同濃度梯度CDDP作用下各組細胞的抑制率（%，±s）

CDDP濃度Hep2組Hep2／siRNA組Hep2／siRNA-control組1μg／ml 17.24±2.03 22.53±2.60 17.02±2.52 2μg／ml 27.23±2.77 33.51±3.61 26.84±2.70 4μg／ml 35.50±3.02 46.07±5.21 35.55±6.14 8μg／ml 44.53±3.60 56.13±5.35 42.34±5.58 16μg／ml 68.55±2.09 75.00±4.20 69.05±4.00

2.3 CDDP對Hep2、Hep2／siRNA、Hep2／siRNA -control組細胞凋亡的影響

2.3.1 熒光顯微鏡觀察 圖2顯示Hep2、Hep2／siRNA、Hep2／siRNA-control三組細胞熒光染色后照片，藍色顯影為4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚（即DAPI）染色后固定的細胞（a、d、g）；綠色顯影為Annexin V染色后細胞，提示早期凋亡（b、e、h）；紅色顯影為PI染色后細胞，提示晚期凋亡（c、f、i）。

圖2 Hep2、Hep2／siRNA、Hep2／siRNA-control組細胞凋亡染色熒光照片

2.3.2 流式細胞儀檢測結(jié)果 CFlow Plus軟件示左上象限Q1為壞死細胞，左下象限Q3為正常細胞，右上象限Q2為晚期凋亡與壞死細胞，右下象限Q4為早期凋亡細胞（圖3）。以Q2+Q4細胞占總細胞數(shù)的百分比計算細胞凋亡率。加入CDDP孵育24 h后CDDP藥物濃度為4μg／ml時，Hep2、Hep2／siRNA、Hep2／siRNA-control三組細胞凋亡率分別為18.4%、26.6%、17.1%，其中，Hep2／siRNA組較Hep2／siRNA-control組的細胞凋亡率絕對值升高9.5%。

圖3 三組細胞Hep2、Hep2／siRNA、Hep2／siRNA-control給予4μg／ml順鉑24 h后在凋亡試劑盒誘導后流式細胞儀檢測四象限圖

3 討論

隨著腫瘤的發(fā)病率增高，腫瘤耐藥性的研究逐漸受到重視，但因各類抗腫瘤藥物結(jié)構(gòu)各異、機制不同，耐藥性研究也困難，特別是惡性腫瘤多耐藥性的出現(xiàn)，使得耐藥機制的研究更顯得迫在眉睫［8］。喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤，化療藥的應用在其綜合治療中起著重要的作用，但化療藥物的耐藥性一直以來是其進一步應用所面臨的難題［］。

Nrf2是重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以進入細胞核內(nèi)與其下游多個基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，誘導靶基因如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NADH-醌氧化還原酶（NQO1）的表達，參與抗氧化反應調(diào)控。Nrf2-ARE信號通路主要受keap1調(diào)控［10］，后者為Cullin3依賴的E3泛素酶連接底物，可捕捉Nrf2并迅速使其泛素化，然后轉(zhuǎn)至蛋白酶體降解，從而使Nrf2在未受到刺激時保持低水平。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）上有著敏感的氧分壓變化感受器［11］，一旦細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多，Keap1分子構(gòu)象適應性改變而使Nrf2逃脫，Nrf2則進入核內(nèi)調(diào)控下游基因表達，從而發(fā)揮抗氧化作用［12］。

Nrf2在腫瘤發(fā)展中的作用尚不十分明確，Nrf2信號通路的增強可以激活細胞防御系統(tǒng)，促進細胞在不利環(huán)境下存活，但研究發(fā)現(xiàn)Nrf2表達增高可促進癌癥發(fā)生及腫瘤耐藥［7，13，14］。Homma等［15］發(fā)現(xiàn)Nrf2可促進人肺癌細胞的增殖及耐藥性；Hayden等［16］發(fā)現(xiàn)Nrf2可促進膀胱癌對順鉑耐藥。

本研究結(jié)果顯示，siRNA干擾Nrf2基因后，喉癌Hep2細胞增殖抑制率較未轉(zhuǎn)染時升高，同時其凋亡率也升高。而順鉑是已知的一類經(jīng)典烷化劑抗腫瘤藥物，其抗腫瘤機制在于誘導caspase-3的細胞凋亡作用［17，18］，干擾Nrf2后細胞凋亡率升高即促進Hep2細胞對順鉑的敏感性，提示Nrf2在抗腫瘤作用中起著促進耐藥的作用；而這一作用也與Nrf2在肺癌［19，20］、膀胱癌［16］、胰腺癌［6］等其他研究中的作用相一致。

總之，本研究運用siRNA技術敲除Nrf2基因探究其在化療敏感性中的作用，結(jié)果提示Nrf2-ARE通路可能在腫瘤耐藥中起著重要作用，此為干擾技術在抗惡性腫瘤中的運用提供了細胞水平的實驗支持。但Nrf2-ARE抗氧化通路參與耐藥的具體環(huán)節(jié)仍有待進一步研究，其上下游調(diào)控基因、轉(zhuǎn)錄及蛋白表達、修飾等也需進一步實驗分析。

1 Lee KW，Kuo WR，Tsai SM，et al.，Different impact from betel quid，alcohol and cigarette：risk factors for pharyngeal and laryngeal cancer［J］.Int J Cancer，2005，117：831.

2 Szyfter K.Molecular and cellular changes following exposure to tobacco smoke causing laryngeal cancer.An outline of the problem［J］.Przegl Lek，2004，61：1197.

3 Zang LY，Stone K，Pryor WA.Detection of free radicals in aqueous extracts of cigarette tar by electron spin resonance［J］. Free Radic Biol Med，1995，19：161.

4 An Y，Kiang A，Lopez JP，et al.Cigarette smoke promotes drug resistance and expansion of cancer stem cell-like side population［J］.PLoS One，2012，7：e47919.

5 Zhang DD，Lo SC，Sun Z，et al.Ubiquitination of Keap1，a BTB-Kelch substrate adaptor protein for Cul3，targets Keap1 for degradation by a proteasome-independent pathway［J］.J Biol Chem，2005，280：30091.

6 Hong YB，Kang HJ，Kwon SY，et al.Nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2 regulates drug resistance in pancreatic cancer cells［J］.Pancreas，2010，39：463.

7 Rushworth SA，Macewan DJ.The role of Nrf2 and cytoprotection in regulating chemotherapy resistance of human leukemia cells［J］.Cancers（Basel），2011，3：1605.

8 Housman G，Byler S，Heerboth S，et al.Drug resistance in cancer：an overview［J］.Cancers（Basel），2014，6：1769.

9 Haigentz M Jr，Silver CE，Hartl DM，et al.Chemotherapy regimens and treatment protocols for laryngeal cancer［J］.Expert Opin Pharmacother，2010，11：1305.

10 Hayes JD，Mc Mahon M，Chowdhry S，et al.Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway［J］.Antioxid Redox Signal，2010，13：1713.

11 Sun Z，Zhang S，Chan JY，et al.Keap1 controls postinduction repression of the Nrf2-mediated antioxidant response by escorting nuclear export of Nrf2［J］.Mol Cell Biol，2007，27：6334.

12 Kensler TW，Wakabayashi N，Biswal S.Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2007，47：89.

13 Kansanen E，Kuosmanen SM，Leinonen H，et al.The Keap1-Nrf2 pathway：Mechanisms of activation and dysregulation in cancer［J］.Redox Biol，2013，1：45.

14 Wang XJ，Sun Z，Villeneuve NF，et al.Nrf2 enhances resistance of cancer cells to chemotherapeutic drugs，the dark side of Nrf2［J］.Carcinogenesis，2008，29：1235.

15 Homma S，Ishii Y，Morishima Y，et al.Nrf2 enhances cell proliferation and resistance to anticancer drugs in human lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，15：3423.

16 Hayden A，Douglas J，Sommerlad M，et al.The Nrf2 transcription factor contributes to resistance to cisplatin in bladder cancer［J］.Urol Oncol，2014，32：806.

17 Reedijk J，Lohman PH.Cisplatin：synthesis，antitumour activity and mechanism of action［J］.Pharm Weekbl Sci，1985，7：173.

18 Lee JU，Hosotani R，Wada M，et al.Mechanism of apoptosis induced by cisplatin and VP-16 in PANC-1 cells［J］. Anticancer Res，1997，17：3445.

19 Ji L，Li H，Gao P，et al.Nrf2 pathway regulates multidrugresistance-associated protein 1 in small cell lung cancer［J］. PLoS One，2013，8：e63404.

20 Kim HR，Kim S，Kim EJ，et al.Suppression of Nrf2-driven heme oxygenase-1 enhances the chemosensitivity of lung cancer A549 cells toward cisplatin［J］.Lung Cancer，2008，60：47.

（2014-11-11收稿）

（本文編輯 李翠娥）

lnhibition of Nrf2 by siRNA Regulates Chemosensitivity of Laryngeal Cancer to Cisplatin

Xu Ji，Zhou Zheng，Li Jiping
（Department of Otorhinolaryngology，Head and Neck Surgery，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai，200127，China）

Objective To determine the inhibitory effect of the synthetic Nrf2 siRNA on the expression of Nrf2 gene in human laryngeal cancer cell lines Hep2 and to investigate the effects of Nrf2 siRNA on chemosensitivity of laryngeal carcinoma to cisplatin by detection growth and apoptosis in Hep2 cells.Methods The recombinant plasmid control siRNA and Nrf2 siRNA were transfected into Hep2 cells，and western blot analysis of Nrf2 expression in Hep2 cells was performed 48 h after transfection.In order to determine whether Nrf2 siRNA can enhance the sensitivity of Hep2 laryngeal cells to cisplatin，we treated Hep2 cells with different concentrations of cisplatin after 24 h，and evaluated these cells for proliferation，and apoptosis.CCK-8 and flow cytometry assay were used for determination of cells proliferation and apoptosis in Hep2 cells.We calculated the inhibition rate and IC50 of the cell after treating with different concentrations of ciplatin.Results The laryngeal carcinoma cell stain Hep2 was transfected by Nrf2 siRNA and control siRNA respectively.The result of western blot showed the Nrf2 expression was significantly impeded at protein levels.CCK-8 assay showed the proliferation of Hep2／Nrf2 siRNA and Hep2／control siRNA was inhibited to 35.55%to 46.07%at 24 h respectively after treating with 4μg／ml cisplatin.The chemosensitivity to cisplatin in Hep2／Nrf2 siRNA was markly increased compared with Hep2／control siRNA.The IC50 in Hep2／Nrf2 siRNA was 5.27μg／ml contrast to 8.107μg／ml compared in Hep2／control siRNA.The result of flow

Laryngeal cancer； Nrf2； siRNA； Chemosensitivity； CDDP

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.04.012

時間：2015-6-17 9：56

R739.6

A

1006-7299（2015）04-0381-05

* 上海市科學技術委員會上海自然基金項目（13ZR1425300）

1 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院耳鼻咽喉科（上海 200127）

徐吉：男，江蘇人，碩士研究生，主要研究方向為鼻及鼻相關疾病的基礎研究。

李吉平（Email：drlijiping@163.com）

網(wǎng)絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150617.0956.027.html

cytometry analysis showed the apoptosis rate after Nrf2 depletion was increased from 17.1%to 26.6%.Conclusion This study demonstrates that Nrf2 siRNA effectively inhibits Nrf2 gene expression in Hep2 cells leading to growth suppression and induction of apoptosis in Hep2 cells under cisplatin.The use of siRNA technique may provide a novel therapeutic approach to treat laryngeal cancer for enhance chemosensitivity.