楊皓然　方　凱　孫曉菲　解宇環(huán)

云南中醫(yī)學院，云南　昆明　650500

實驗研究

六君子湯對皮膚屏障功能障礙小鼠的影響

楊皓然方凱孫曉菲解宇環(huán)*

云南中醫(yī)學院，云南昆明650500

【摘要】目的：觀察六君子湯對皮膚屏障功能障礙小鼠的影響。方法：采用膠帶法復制皮膚屏障功能障礙小鼠模型，觀察正常組、模型組和六君子湯給藥組小鼠經(jīng)皮水分丟失量(TEWL)和神經(jīng)酰胺含量的差異。結(jié)果：模型組小鼠TEWL值上升(P<0.01)、表皮神經(jīng)酰胺含量下降(P<0.05)；六君子湯各給藥組能不同程度的降低TEWL值和升高神經(jīng)酰胺含量。結(jié)論：六君子湯可改善皮膚屏障功能障礙小鼠的皮膚機械屏障功能，機制可能與提高表皮神經(jīng)酰胺含量有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】六君子湯；皮膚屏障功能障礙；經(jīng)皮水分丟失量；神經(jīng)酰胺

皮膚屏障包括皮膚的機械屏障、免疫屏障、神經(jīng)屏障以及其他與皮膚功能相關(guān)方面，狹義的皮膚屏障常指表皮，尤其是角質(zhì)層的機械性屏障[1]。機械屏障直接與外界接觸，是機體與外界環(huán)境之間的屏障。該屏障對外界物理性、化學性、細菌等微生物損傷具有防護作用，并有助于維持皮膚的完整性，防止體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)、水份等的丟失。皮膚屏障功能的障礙可誘發(fā)濕疹、特應性皮炎、銀屑病等皮膚疾病。中醫(yī)臨床治療本類疾病過程中，無論哪一種證型，都應兼顧脾胃，而健脾法是治療皮膚屏障障礙相關(guān)疾病的重要方法。本研究選用益氣健脾經(jīng)典方劑六君子湯，觀察其對模型小鼠皮膚機械屏障障礙的影響，以初步探討健脾方藥對皮膚機械屏障功能的作用。

1儀器與材料

1.1動物SPF級ICR小鼠，雌雄各半，體重18~22g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。合格證號：SCXK(京)2014-0004。

1.2藥品與試劑六君子湯：人參36g，茯苓36g，炒白術(shù)36g，炙甘草24g，陳皮12g，半夏18g，藥材購自昆明市“一心堂”連鎖藥店，均由中藥鑒定教研室張潔老師鑒定為正品。按方中比例水煎、過濾、濃縮制成浸膏，4℃保存；神經(jīng)酰胺標準品(美國sigma aldrich公司)；胰酶(Lot No：MR28175，法國)；其余試劑均為分析純。

1.3儀器YLS-Q4 耳腫打耳器(直徑為8mm，山東省醫(yī)學科學院設(shè)備站)； HX086146 薄層色譜硅膠板(德國Merck公司)；Vapo Meter測量儀(芬蘭Delfin Technologies公司)。

2方法

2.1動物分組及處理將健康ICR小鼠，根據(jù)體重分層隨機分為5組。即正常對照組、模型組、六君子湯高、中、低劑量組。除六君子湯各組分別灌胃給予不同濃度的的六君子湯水煎液外，其余各組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)13d。除正常對照組外，其余各組從給藥第9天起，以膠帶法[2]復制皮膚機械屏障障礙模型，連續(xù)5d。造模各組于造模前1天，剃去小鼠頸背部被毛。

2.2表皮經(jīng)皮水分丟失量(TEWL)測定造模第5天，用Vapo Meter測量儀測定小鼠頸背部皮膚TEWL值，室溫20～25℃，空氣相對濕度50%～60%。測量儀器與測量部位皮膚表面垂直接觸，每一測試部位測量3次，讀出數(shù)值并記錄，取其平均值。

2.3表皮神經(jīng)酰胺含量的測定

2.3.1表皮脂質(zhì)的提取造模第5天，檢測完TEWL值后將小鼠處死，取下頸背部皮膚，用打耳器打成面積約為50mm2大小的皮膚圓片共6片。將所取皮片浸泡于胰酶中，37℃水浴1h，4℃冰箱放置過夜后取出，分離表皮，抽提表皮脂質(zhì)，氮氣吹干，-80℃冰箱保存。

2.3.2對照品的制備稱取神經(jīng)酰胺對照品5.0 mg，置5ml容量瓶中，加氯仿適量，振搖溶解，定容后從中精密吸取1ml溶液，加氯仿定容至5ml，即得0.2mg/ml對照品溶液。

2.3.3線性關(guān)系考察精密吸取2、4、6、8、10、12、14μl神經(jīng)酰胺對照品溶液點于薄層板上展開(展開劑為正己烷-乙酸乙酯=3∶1)，晾干后再于氯仿-甲醇-氨水(90∶10∶0.5)中展開；噴灑顯色劑于140℃下烘干顯色。顯色后采集圖片并用Image J軟件分析，測定灰度值。經(jīng)計算得到回歸方程y=5346.3x+4222.2，R2=0.9973，線性關(guān)系良好，線性范圍為0.4~2.8μg。

2.3.4神經(jīng)酰胺含量測定吸取對照品溶液、供試品溶液，按上述條件測定灰度值，最終換算出神經(jīng)酰胺含量。

3結(jié)果

3.1對皮膚TEWL值的影響由表1可知，與正常對照組比較，皮膚屏障功能障礙小鼠TEWL值增加(P<0.01)；與模型對照組比較，六君子湯三個劑量組均能降低TEWL值(P<0.01)。

表1　六君子湯對皮膚屏障障礙小鼠皮膚TEWL值的影響

注：與正常對照組比較，△△P<0.01；與模型對照組比較，**P<0.01。

3.2對神經(jīng)酰胺含量的影響與正常對照組比較，皮膚屏障障礙小鼠神經(jīng)酰胺含量降低(P<0.05)；與模型對照組比較，六君子湯高、中劑量組均能增加神經(jīng)酰胺含量(P<0.05)。見表2。

表2　六君子湯對皮膚屏障障礙小鼠皮膚神經(jīng)酰胺含量的影響

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較，*P<0.05。

4討論

有學者將皮膚屏障比喻為“磚墻”結(jié)構(gòu)，角質(zhì)細胞好比“磚”，而細胞間脂質(zhì)好比“灰漿”，它將角質(zhì)細胞緊密地連接起來，使皮膚屏障功能正常[3]。細胞間脂質(zhì)主要是由膽固醇、脂肪酸和神經(jīng)酰胺以適當?shù)谋壤M成。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酰胺約占總脂質(zhì)的50%，是脂質(zhì)的主要組成成分，在皮膚屏障修復中起主要作用，若除去神經(jīng)酰胺就能使表皮層屏障功能幾近喪失[4]。阻止水分經(jīng)皮擴散和丟失，這是皮膚最重要的屏障功能之一，TEWL反映的是水從皮膚表面蒸發(fā)量，所以是評價皮膚屏障功能的重要指標，TEWL值越高，說明經(jīng)皮膚散失的水分越多，角質(zhì)層的屏障功能也越差[5]。

研究采用膠帶法破壞小鼠皮膚屏障后，導致小鼠皮膚TEWL值上升的同時表皮神經(jīng)酰胺含量下降，表明小鼠皮膚機械屏障功能受損。而六君子湯給藥后，小鼠TEWL值下降，小鼠皮膚機械屏障功能得以恢復。說明六君子湯能改善小鼠皮膚機械屏障功能，其機制與增加表皮神經(jīng)酰胺含量有關(guān)。

參考文獻

[1]Lang C, Kypriotou M, Christen-Zaech S.Pathogenesis of atopic dermatitis[J].Rev Med Suisse. 2010，28(6):860-865.

[2]李軍，陳謹萍，吳伽.一氧化氮對小鼠皮膚ABCA12表達及屏障功能的影響[J]. 廣東醫(yī)學，2010，31(12)：1512-1514.

[3]田燕，劉瑋.皮膚屏障[J].實用皮膚病學雜志，2013,6(6)：346-348.

[4]胡珍，于春水.皮膚屏障功能的研究進展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013，7(7)：3101-3103.

[5]趙鑫.TEWL 在評價皮膚屏障功能研究中的應用[J].廣東化工，2014，41(14)：133-134.

(收稿日期：2015.09.07)

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2015)24-0012-02