張海燕，王 捷，冼 江(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科，廣州 510010)

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·論 著·

瓊脂糖電泳中核酸染料Genefinder的最佳使用方法建立

張海燕，王 捷△，冼 江
(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科，廣州 510010)

目的 確定瓊脂糖凝膠電泳中使用核酸染料Genefinder的最適方法，以期找到染色效果理想的染色方法。方法 在瓊脂糖凝膠電泳中，采用預(yù)染樣品法、膠內(nèi)染色法以及兩者相結(jié)合的3種方法，使用核酸染料Genefinder進行染色，對染色結(jié)果進行比較分析。結(jié)果 使用膠內(nèi)染色法染色效果較好，預(yù)染樣品法次之，膠染及樣品染色法結(jié)合效果最差。結(jié)論 核酸染料Genefinder會影響DNA的遷移效率，使用Genefinder進行膠內(nèi)染色是一種較好的染色方法。

Genefinder； 樣品預(yù)染法染色； 膠內(nèi)染色

溴化乙錠(EB)曾是瓊脂糖凝膠電泳中最為常用的核酸染料,被廣泛應(yīng)用于觀察、檢測DNA/RNA。但作為一種強誘變劑,EB可插入核酸相鄰堿基平面之間，引起基因突變，具有中等毒性，對人體有潛在的危害性[1-3]。Genefinder是一種新型核酸染料，與強致癌性的EB不同，Genefinder屬于花青類染料，毒性低，使用安全,可以代替EB作為各種核酸電泳的染色劑。那么,新型核酸染料是預(yù)染樣品法、膠內(nèi)染色法還是兩者相結(jié)合的染色方法檢測靈敏度最高,最實用呢?本文在3種染色方式下使用Genefinder核酸染料對凝膠中的DNA進行染色，對染色結(jié)果進行比較分析,為實驗中選擇合適的Genefinder染色方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗使用的核酸樣品為本實驗室擴增獲得的EGFR基因20號外顯子的PCR產(chǎn)物(約110 bp)。

1.1.2 試劑 核酸染料Genefinder(10 000×) (百維信生物科技有限公司)；6×loading buffer[寶生物工程(大連) 有限公司]；DNA Marker DL2000[寶生物工程(大連) 有限公司]；瓊脂糖膠Agarose gels(Oxoid,England)。

1.1.3 儀器 藍(lán)盾552可見光凝膠電泳透射儀(百維信生物科技有限公司，廈門)，621藍(lán)盾可見光透射儀(百維信生物科技有限公司，廈門)，微量移液器(eppendorf，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 膠染法 配制1.5%的瓊脂糖溶液，加熱溶解，冷卻至60 ℃左右，按比例加入10 000×Genefinder染料，使染料在膠中的終濃度為1×(即如果制備50 mL 凝膠，加入5 μL的10 000×Genefinder染料),然后倒膠。待凝膠液冷卻凝固后，加入DL2000 核酸標(biāo)準(zhǔn)物及PCR產(chǎn)物進行電泳。使用5 V/cm 的電壓進行電泳，最后用621藍(lán)盾可見光透射儀進行觀察拍照。

1.2.2 預(yù)染樣品法 按照常規(guī)方法配制1.5%瓊脂糖凝膠，制膠過程中不加入Genefinder染料。配制loading buffer預(yù)染液:將10 000×Genefinder染料和6×loading buffer按照1∶9的比例混合(如5 μL染料和45 μL的6×loading buffer混合)。將需要進行電泳檢測的PCR產(chǎn)物及DL2000 核酸標(biāo)準(zhǔn)物與配置好的loading buffer預(yù)染液按照5∶1混合，室溫靜置3 min后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓5 V/cm，電泳結(jié)果用621藍(lán)盾可見光透射儀進行觀察拍照。

1.2.3 膠染法+預(yù)染樣品法 配制1.5%的瓊脂糖溶液，加熱溶解，冷卻至60 ℃左右，按比例加入10 000×Genefinder染料，使染料在膠中的終濃度為1×Genefinder染料,然后倒膠。將需要進行電泳檢測的PCR產(chǎn)物及DL2000 核酸標(biāo)準(zhǔn)物與配置好的loading buffer預(yù)染液按照5∶1混合，室溫靜置3 min后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓5 V/cm，電泳結(jié)果用621藍(lán)盾可見光透射儀進行觀察拍照。

2 結(jié) 果

3種染色方法電泳后進行染色效果的比較，見圖1～3。圖3中電泳條帶模糊、不整齊，且有較明顯的拖尾現(xiàn)象，DL2000 MARK 中分子大小不同的DNA片段不能清晰分辨；圖2中條帶模糊的問題稍有改善，DNA樣品仍有少量的拖尾現(xiàn)象，DL2000 MARK 中分子大小不同的DNA片段能進行區(qū)分，但清晰度不佳；圖1的染色效果明顯比前兩者染色的效果好得多，結(jié)果中核酸分子的條帶清晰、整齊，背景低，信噪比相對高，條帶邊緣銳利，便于顯示實驗結(jié)果(圖1)。電泳中使用的核酸樣品是同一批樣品，但是比較膠法染色(圖1)、預(yù)染樣品法染色(圖2)及兩者相結(jié)合的染色方法(圖3)，發(fā)現(xiàn)3種方法顯示的核酸分子的大小不完全一致。這可能是樣品加入染料后，影響了樣品的遷移速率，以致不能準(zhǔn)確地判斷DNA條帶的大小。

注：M為DL2000 Marker；泳道1、2、3為核酸樣品。

圖1 膠染法染色

注：M為DL2000 Marker；泳道1、2、3為核酸樣品。

圖2 預(yù)染樣品法染色

注：M為DL2000 Marker；泳道1、2、3為核酸樣品。

圖3 膠染法+預(yù)染樣品法

3 討 論

EB因其在核酸電泳中有著條帶邊緣清晰、背景低、靈敏度高的優(yōu)點，曾經(jīng)是實驗室用于檢測核酸的常規(guī)染料。但由于EB是一種強誘變劑并具有一定的致癌性而逐漸減少使用。Genefinder 是近幾年推出的新型熒光核酸染料，屬于花青類染料，毒性低，使用安全，可有效保護操作者和環(huán)境。Genefinder與核酸結(jié)合后的最大吸收峰為490 nm,與染料結(jié)合的核酸在紫外線下呈現(xiàn)綠色熒光。但該染料同樣能引起有機體突變，在使用時要采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo措施[4-6]。有報道表明，新型熒光核酸染料在成本、靈敏度、安全性方面都具有較大優(yōu)勢，適合實驗室的常規(guī)核酸檢測，可以作為EB的替代品[7]。但是，不同的染色方式下，檢測效果有很大差異，通過比較圖1～3可以看出，使用膠染法染色Genefinder 對100～2 000 bp的核酸分子，其顯色效果條帶清晰，平直，邊緣整齊；預(yù)染樣品法和兩者相結(jié)合的染色方法都會導(dǎo)致核酸條帶模糊拖尾及DNA MARK分辨率不高的現(xiàn)象。這個結(jié)果與劉陽等[8]的研究結(jié)果是一致的，不論是對于EB還是新型核酸染料，使用膠染法的靈敏度較高。此外，在實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Genefinder在上樣前與DNA混勻后再電泳時,DNA片段的電泳遷移率會有一定程度的降低,因此,不能用于準(zhǔn)確地判斷DNA條帶的大小,只適用于簡單的電泳試驗，如膠回收、簡單PCR產(chǎn)物分析等。上述結(jié)果提示,對于PCR產(chǎn)物而言,條帶大小的不同可能是PCR產(chǎn)物的大小不同或同一PCR產(chǎn)物的染料濃度不同所致[8-10]。

綜上所述，Genefinder 是花青素類的染料，安全、環(huán)保，靈敏度高，對瓊脂糖凝膠中的DNA/RNA 進行染色，可以作為EB的替代品用于實驗室的常規(guī)檢測；在實驗條件相同的情況下，使用膠染法進行染色可以得到清晰整齊的染色條帶，與預(yù)染樣品法及膠染法+預(yù)染樣品法相比較，是比較理想的染色方式，而且可以減少電泳中Genefinder對核酸遷移率的影響。

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Establishment of optimal use method of nucleic acid dyes Genefinder in agarose gel electrophoresis

ZHANGHai-yan,WANGJie△,XIANJiang
(DepartmentofMedicalEperiment,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryRegion,Guangzhou,Guangdong510010,China)

Objective To determine a optimal method for using nucleic acid dyes Genefinder in agarose gel electrophoresis in order to find out a staining method with ideal dyeing effect.Methods The pre-dyeing sample method,gel staining method and their combination staining method were adopted to perform the staining with nucleic acid dyes in agarose gel electrophoresis.The staining results were performed the comparative analysis.Results The Genefinder staining had better effect，the pre-dyeing sample method took the second place and the combination staining method had the worst effect.Conclusion Nucleic acid dyes Genefinder has an effect on the mobility of nucleic acid in agarose gel electrophoresis,therefore staining nucleic acid with Genefinder is a better staining method in agarose gel electrophoresis.

Genefinder; staining with preparative dye liquor; staining in agarose gel electrophoresis

張海燕，女，主管技師，博士，主要從事腫瘤分子病理診斷研究?！?/p>

，E-mail:jiew@tom.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.020

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1672-9455(2015)21-3184-02

2015-02-15

2015-07-06)