梅序橋,吳阿陽,鄭燕蘋,陳宏浦,鄭源海,楊惠聰,張佳林(福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院：.檢驗科；.血液科，福建漳州 363000)

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·論 著·

類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血T淋巴細胞亞群CD4+/CD8+表達的意義*

梅序橋1,吳阿陽1,鄭燕蘋1,陳宏浦2,鄭源海1,楊惠聰1,張佳林2
(福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院：1.檢驗科；2.血液科，福建漳州 363000)

目的 探討類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血T淋巴細胞亞群CD4+/CD8+的表達變化對疾病進展的關(guān)系。方法 采用流式細胞術(shù)檢測94例RA患者和22例健康對照者外周血T淋巴細胞亞群CD4+/CD8+。其中94例RA患者按RA疾病活動指數(shù)(DAS28)評分分為低值、中值、高值3組。結(jié)果 與健康對照組比較，RA組外周血中CD3+CD4+T淋巴細胞的表達率明顯升高(P<0.05)，其中CD3+CD4+T淋巴細胞在DAS28低值組為(41.03±9.53)%，DAS28中值組為(42.16±7.08)%，DAS28高值組為(43.72±9.63)%；CD3+CD8+T淋巴細胞表達率明顯降低(P<0.05)，其中CD3+CD8+T淋巴細胞在DAS28低值組為(21.33±6.67)%，DAS28中值組為(21.39±7.36)%，DAS28高值組為(21.28±6.60)%。結(jié)論 CD4+/CD8+比值與RA患者疾病進程相關(guān)，表明CD4+/CD8+失衡在RA的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。

類風濕關(guān)節(jié)炎； 流式細胞； T淋巴細胞亞群

類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的關(guān)節(jié)慢性炎癥的自身免疫性疾病，病理顯示T淋巴細胞在關(guān)節(jié)炎癥中浸潤和滲出[1]。CD3被認為是所有T細胞均表達的共同標志性抗原，參與T細胞的信號轉(zhuǎn)導，CD3+CD4+T淋巴細胞是T淋巴細胞中重要的亞群，激活后分化成特定的免疫輔助性T細胞，分泌白細胞介素(IL)-4、IL-17、干擾素(INF)-γ等細胞因子，進一步促進免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。研究表明CD3+CD4+T淋巴細胞在RA的發(fā)病機制中有重要作用[2]，CD3+CD4+T淋巴細胞識別自身抗原而活化，導致炎癥因子分泌增加，使自身免疫應(yīng)答機制失衡，從而造成RA關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)[3]。盡管CD3+CD8+T淋巴細胞是免疫系統(tǒng)主要的效應(yīng)細胞，能夠發(fā)揮細胞毒性效應(yīng)，但其在自身免疫性疾病中的作用研究較少。T淋巴細胞亞群中CD4+/CD8+比例的失衡與多種自身免疫性疾病相關(guān)，本文采用流式細胞術(shù)檢測RA患者及健康者外周血CD3、CD4、CD8陽性T淋巴細胞的表達情況，探討其在RA疾病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院2013年6～12月門診及住院的RA患者 94 例(RA組)，其中男24例，女70例；年齡16～81歲，平均(50.32±11.70)歲；均符合美國風濕病協(xié)會(ACR) 2010 年修訂的診斷標準[4]。健康對照組 22 例，其中男4 例，女 18 例；年齡23～72 歲，平均(44.77±15.22)歲；為同期本院健康志愿者，均排除自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病。RA病情活動度以RA疾病活動指數(shù)(DAS28)評分為標準[5]，將RA患者分為低度活動期(DAS28<3.2)22例，其中男9例、女13例，平均年齡(47.09±3.03) 歲；中度活動期(DAS28 3.2～5.1)40例，其中男9例、女31例，平均年齡(53.31±1.85)歲；高度活動期(DAS28>5.1)32例，其中男6例、女26例，平均年齡(50.03±1.64)歲。3組研究對象在年齡、性別構(gòu)成方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會通過，針對研究對象的采樣均獲得研究對象的知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 Anti-Human CD4-FITC / CD8-PE / CD3-PerCP組合抗體(美國BD公司)，紅細胞裂解液(美國Beckman公司)，BD FACSCantoTMⅡ流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 方法 經(jīng)確診的RA患者及健康對照者，均晨起空腹采集肘靜脈血2 mL，用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝。每份標本分別加入50 μL抗凝全血。T標記的試管中加入20 μL的組合抗體CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP,渦旋振蕩混勻，室溫，避光孵育15 min。加入400 μL紅細胞裂解液，振蕩混勻，室溫避光8～10 min。每管中加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS),振蕩混勻，1 500 r/min,離心5 min，棄上清液。再加入1 mL PBS重懸細胞，上機分析。

2 結(jié) 果

RA各組CD3+T淋巴細胞水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而CD3+CD4+T淋巴細胞水平及CD4+/CD8+比值均明顯高于對照組(P<0.05)，CD3+CD8+T淋巴細胞明顯低于對照組(P<0.05)，然其在RA不同活動期組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1，圖1、2。

圖1 流式細胞儀T淋巴細胞亞群CD4/CD8/CD3檢測示意圖

組別nCD3+CD3+CD4+CD3+CD8+低度活動期2269．10±8．4741．03±9．53?21．33±6．67?中度活動期4070．10±7．9942．16±7．08?21．39±7．36?高度活動期3270．26±9．8143．72±9．63?21．28±6．60?對照組2271．59±6．8036．67±6．2926．24±7．07

注：與對照組比較，*P<0.05。

注：*表示P<0.05。

圖2 RA患者與健康者外周血CD4/CD8比較

3 討 論

RA是臨床常見的自身免疫性疾病，在中國的發(fā)病率約為4‰，它的發(fā)病機制涉及多種因素，主要由免疫機制引起，有多種免疫細胞和細胞因子的參與。研究表明T淋巴細胞亞群的失衡在RA疾病的進程中發(fā)揮重要作用，尤其是當CD4/CD8平衡被破壞時，患者便表現(xiàn)出關(guān)節(jié)慢性炎癥等相關(guān)臨床癥狀[6]。T淋巴細胞按其表面抗原的表達，又分為CD3+CD4+亞群和CD3+CD8+亞群，CD4+T淋巴細胞又稱為輔助性T細胞，它可以分泌大量的細胞因子，誘導體液免疫細胞激活，同時通過信號傳導，激活CD8+T淋巴細胞。CD8+T淋巴細胞通過多種機制發(fā)揮細胞毒性作用，殺傷靶細胞。研究表明CD4+T/CD8+T淋巴細胞的平衡與多種自身免疫性疾病相關(guān)[7]。

CD4分子在T淋巴細胞發(fā)育及成熟過程中發(fā)揮重要作用，它可以促進T淋巴細胞的活化以及信號轉(zhuǎn)導，是適應(yīng)性免疫應(yīng)答發(fā)生的重要效應(yīng)分子。當機體內(nèi)淋巴細胞的CD4分子異常表達時，即可能導致疾病的發(fā)生。Dejaco等[8]研究發(fā)現(xiàn)在AS患者的外周血及關(guān)節(jié)腔滑液中可以檢測到CD4+T淋巴細胞的活化，并且分泌高水平的炎癥因子IFN-γ、IL-6、TNF-α與IL-2等，促進RA發(fā)展[9]。也有研究報道RA患者CD4+T細胞高表達CD40L，這可能延長和增強CD4+T淋巴細胞的活化，加重疾病的程度。動物模型試驗表明CD4+T淋巴細胞可以導致自身免疫性的關(guān)節(jié)損傷[10]。此外靜脈注射抗CD4 mAb的靶向治療發(fā)現(xiàn)，初次治療C-反應(yīng)蛋白的水平出現(xiàn)短暫降低，而循環(huán)中CD4+T淋巴細胞的數(shù)量沒明顯改變，再次治療后，IL-2和IFN-γ mRNA表達明顯降低[11]；同時采用免疫組化發(fā)現(xiàn)滑膜組織中浸潤炎癥細胞數(shù)量減少及黏附分子的表達明顯降低，RA患者關(guān)節(jié)炎癥狀得到很大改善[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA的DAS 28各組CD3+CD4+T淋巴細胞明顯高于對照組，表明在RA中CD4分子處于一種異常表達狀態(tài)，但DAS 28各組的CD3+CD4+T淋巴細胞相互比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這可能與本次病例選擇的數(shù)量較少有關(guān)系。

CD8+T淋巴細胞的表達減低或是缺失，能導致機體的免疫功能下降，引發(fā)自身免疫性疾病，這在幾種自身免疫性疾病動物實驗?zāi)Ｐ椭械玫阶C實[13-15]。但CD8+T淋巴細胞在RA動物模型中的作用存在爭議[16-17]。CD8+T淋巴細胞缺乏的SCW的大鼠模型能誘導早期的RA發(fā)病和延長RA病程；而在CD8+T淋巴細胞缺乏的CIA老鼠模型未出現(xiàn)對于RA的誘導，提示CD8+T淋巴細胞在RA的病理機制中的作用并不顯著。然而，敲除CD8+T淋巴細胞的小鼠在經(jīng)過初始免疫的刺激之后才對疾病的進程有影響，表明CD8+T淋巴細胞并沒有在RA發(fā)病的初始階段發(fā)揮作用，而是在RA的效應(yīng)階段發(fā)揮重要的作用[18]。Masuko-Hongo等[19]發(fā)現(xiàn)RA患者的滑液聚集的寡克隆T細胞主要是CD8+細胞，它們的存在超過一年，主要表達CD25或CD45RO分子，表明這些細胞是記憶細胞。說明了長期存在的CD8+T淋巴細胞參與了RA慢性關(guān)節(jié)炎癥進程。RA易感性的基因是HLA-DR8。Taneja等[20]報道證實了DQ8CD4-/-小鼠能抵抗膠原蛋白所誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)，然而DQ8CD8-/-小鼠相對于DQ8鼠增加CIA的發(fā)生率與疾病的嚴重度。這又說明了CD4+T淋巴細胞啟動CIA，而CD8+T淋巴細胞則起免疫調(diào)節(jié)/保護的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RA的DSA28各組CD3+CD8+T淋巴細胞明顯低于對照組，說明CD3+CD8+T淋巴細胞對RA疾病的進展還是有一定的影響，盡管DSA28各組的CD3+CD4+T淋巴細胞相互比較并沒有顯著性差異。故作者認為CD8+T淋巴細胞在RA的病理機制還有待進一步的研究。

淋巴細胞亞群CD4/CD8比例的失衡可導致多種自身免疫性疾病。有研究發(fā)現(xiàn)RA患者外周血CD4+T淋巴細胞比例升高，CD8+T淋巴細胞無顯著變化，CD4+/CD8+比值明顯升高，CD4+/CD8+比例的失衡與RA的發(fā)病密切相關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA組CD3+CD4+T淋巴細胞水平及CD4+/CD8+比值均明顯高于對照組，CD3+CD8+T淋巴細胞明顯低于對照組，然其在RA不同活動期組間，CD4+T淋巴細胞、CD4+/CD8+比值表現(xiàn)增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義；CD3+T淋巴細胞無顯著性變化。本結(jié)果所顯示的CD8+T淋巴細胞的減少與李忠等[22]的結(jié)果相一致，證明了T淋巴細胞，尤其是CD4+T淋巴細胞參與RA發(fā)生、發(fā)展，CD4+/CD8+失衡在RA的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用且可能與疾病的嚴重程度相關(guān)。

綜上所述，RA患者CD4+/CD8+比值升高，且隨著疾病程度加重，CD4+/CD8+比值也有增高的趨勢，表明CD4+/CD8+失衡在RA的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，CD4+/CD8+比值可作為RA診斷及疾病進展程度判斷的參考指標。

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Expression and significance of peripheral blood T-lymphocytes subsets CD4/CD8 in patients with rheumatoid arthritis*

MEIXu-qiao1,WuA-yang1,ZHENGYan-ping1,CHENHong-pu2,ZHENGYuan-hai1,YANGHui-cong1,ZHANGJia-lin2
(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofHematology,AffiliatedZhangzhouMunicipalHospital,FujianMedicalUniversity,Zhangzhou,Fujian363000,China)

Objective To investigate the correlation between the change of peripheral blood T-lymphocyte subsets CD4/CD8 with the disease progress in the patients with rheumatoid arthritis(RA).Methods The peripheral blood T-lymphocytes subsets CD4/CD8 in 94 patients with RA and 22 healthy controls were examined by flow cytometry.94 cases of RA were divided into low value,median value and high value groups by RA disease activity index (DAS28) scores.Results Compared with the healthy controls,the expression rate of peripheral blood CD3+CD4+T cells in the RA group was increased significantly (P<0.05),in which CD3+CD4+T cells were (41.03±9.53)% in DAS28 low value group,(42.16±7.08)% in DAS28 median value group and (43.72±9.63)% in DAS28 high value group.The expression rate of CD3+CD8+T was significantly decreased (P<0.05),in which CD3+CD8+T cells were (21.33±6.67)% in DAS28 low value group,(21.39±7.36)% in DAS28 median value group and (21.28±6.60)% in DAS28 high value group.Conclusion CD4+/CD8+ratio is associated with RA progression,indicating that the CD4+/CD8+imbalances plays an important role in the pathogenesis of RA.

rheumatoid arthritis; flow cytometry; T-lymphocytes subsets

福建省衛(wèi)生廳青年科研課題立項(2011-2-51)。

梅序橋，男，主管技師，博士，主要從事血液學疾病的實驗室診斷。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.005

A

1672-9455(2015)21-3144-03

2015-03-04

2015-07-08)