張博林(四川省廣元市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 628000)

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·臨床探討·

廣元地區(qū)新生兒黃疸葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變分析

張博林
(四川省廣元市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 628000)

目的 探討廣元地區(qū)新生兒黃疸的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性及G6PD常見基因突變，為臨床診斷及治療提供一定的依據(jù)。方法 選取廣元市中心醫(yī)院2013年1月至2014年6月兒科收治的新生兒黃疸患兒126例，進(jìn)行G6PD熒光斑點(diǎn)定性試驗(yàn)初篩及G6PD活性測(cè)定確診，然后對(duì)確診為G6PD缺乏的患兒進(jìn)行常見基因分型，檢測(cè)其突變基因。結(jié)果 126例新生兒黃疸患兒中， G6PD常見基因突變31例，發(fā)病率為24.6%，突變以G1388A(G-A)為主，共23例，占基因突變比例為74.2%(23/31)，而G1376T(G-T)和A95G(A-G)突變各占12.9%。結(jié)論 廣元地區(qū)新生兒患G6PD缺乏癥者多數(shù)為G1388A(G-A)突變，亦屬于G6PD缺乏癥高發(fā)地區(qū)。

新生兒黃疸； 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶； 基因突變

新生兒高膽紅素血癥是兒科常見病，是由于新生兒期體內(nèi)膽紅素積累過多而引起的皮膚黏膜或組織器官的黃染，近年來發(fā)病率漸增，可發(fā)生于50%的足月兒和80%的早產(chǎn)兒，其形成原因較為復(fù)雜，若不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成永久性損害，導(dǎo)致新生兒智力明顯降低，嚴(yán)重者可致死亡[1-2]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是導(dǎo)致新生兒黃疸的一個(gè)重要病因，G6PD缺乏是一種X性染色體連鎖不完全顯性遺傳的紅細(xì)胞酶的缺陷病，本病在全球廣泛分布，不同地區(qū)民族有顯著差異。本文探討廣元地區(qū)新生兒黃疸患兒的G6PD活性及G6PD常見基因突變，為臨床診斷及治療提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣元市中心醫(yī)院2013年1月至2014年6月兒科收治的新生兒黃疸126例，其中男72例、女54例，平均年齡1～28 d。新生兒病理性黃疸判斷標(biāo)準(zhǔn)：血液24 h膽紅素水平大于102.6 μmol/L，48 h膽紅素水平大于154.0 μmol/L，3 d以上膽紅素水平大于220.6 μmol/L，排除其他因素(母嬰血型不合、紅細(xì)胞增多、先天畸形等)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有病例均采集乙二胺四乙酸三鉀(EDTA-K3)抗凝靜脈血2～3 mL。分離血漿于-20 ℃保存。

1.2.2 篩查 (1)G6PD熒光斑點(diǎn)定性試驗(yàn)：采用廣州米基公司生產(chǎn)的熒光斑點(diǎn)法試劑盒進(jìn)行篩查，按照說明書標(biāo)準(zhǔn)操作。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：<10 min內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)熒光為活性正常；10～30 min出現(xiàn)熒光為中度缺乏；>30 min不出現(xiàn)熒光為重度缺乏或者完全缺乏。(2)G6PD酶活性測(cè)定：采用廣東中山天洋公司生產(chǎn)的G6PD/6PGD定量比值法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)G6PD活性，按照標(biāo)準(zhǔn)操作。G6PD/6PGD結(jié)果判定參考范圍：G6PD/6PGD≥1.1為G6PD正常；>0.6～<1.1為中度缺乏；≤0.6為重度缺乏。

1.2.3 基因分型 (1)基因組DNA制備。取經(jīng)熒光斑點(diǎn)定性試驗(yàn)初篩及酶活性測(cè)定確診為G6PD缺乏的全血標(biāo)本，按照常規(guī)方法處理，蛋白酶K進(jìn)行56 ℃消化，酚-異戊醇-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，TE溶解。(2)G6PD常見基因檢測(cè)。本試驗(yàn)僅檢測(cè)常見的G6PD基因G1388A(G-A)、G1376T(G-T)和A95G(A-G)突變。檢測(cè)1388突變上游引物：5′-ACA CTC TCT CCC TCA CA-3′；下游引物：5′-GTG CAG CAG TGG GGT GAA CAT-3′。檢測(cè)1376突變上游引物：5′-ACA CTC TCT CCC TCA CA-3′；下游引物：5′-TGA AAA TAC GCC AGG CCT CG-3′。檢測(cè)95突變上游引物：5′-TGC TCT CCT GTT CTT CTG CC-3′；下游引物：5′-CGA TGC ACC CAT GAT ATG AGC ATG-3′。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，含模板DNA 1 μL，緩沖液(Tris-HCl 10 mmol/L,pH9.0 KCl 0.5 mmol/L,MgCl215 mmol/L),dNTP各200 μmol/L,兩對(duì)引物各200 nmol/L，Taq酶2 U，加一滴石蠟油95 ℃變性5 min后進(jìn)入循環(huán)：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)30次，最后于73 ℃保溫延伸5 min。取8 μL PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用溴酚藍(lán)染液染色鑒定，在紫外成像儀下顯色照相。

2 結(jié) 果

2.1 G6PD篩查結(jié)果 126例新生兒黃疸患兒中，G6PD熒光斑點(diǎn)定性試驗(yàn)G6PD活性中度缺乏26例，其中男16例，女10例；G6PD活性重度缺乏8例，其中男6例，女2例；G6PD酶活性測(cè)定中度缺乏22例，其中男13例，女9例；G6PD酶活性測(cè)定重度缺乏9例，其中男7例，女2例。見表1。

表1 126例新生兒黃疸患兒G6PD篩查結(jié)果(n)

2.2 G6PD常見基因檢測(cè) G6PD常見基因突變共31例，發(fā)病率為24.6%。其中G6PD酶活性測(cè)定確診為中度缺乏的患兒中G1388A突變22例(男13例，女9例)；G6PD酶活性測(cè)定確診為重度缺乏的患兒中G1388A突變7例(男5例，女2例)，G1376T突變1例(為男性)，A95G突變1例(為男性)。突變以G1388A(G-A)為主，共23例，占基因突變比例為74.2%(23/31)，而G1376T(G-T)和A95G(A-G)突變各占12.9%。

3 討 論

新生兒黃疸成因較為復(fù)雜，G6PD缺乏是原因之一，是一種紅細(xì)胞酶的缺陷病，由紅細(xì)胞內(nèi)磷酸戊糖旁路的遺傳性缺陷造成[3]。屬于X染色體顯性遺傳，男性半合子和女性純合子表現(xiàn)為G6PD嚴(yán)重缺乏，而女性雜合子部分表現(xiàn)為G6PD缺乏，部分表型正常，故男性發(fā)病率明顯高于女性，我國處于G6PD缺乏高發(fā)區(qū)，發(fā)病率分布南方高北方低，各地發(fā)病率報(bào)道不一[4-8]。由G6PD缺乏導(dǎo)致核黃疸的發(fā)生率比新生兒ABO溶血更高，且可在血清膽紅素較低的水平時(shí)發(fā)生，是新生兒的急癥之一[9]。黃疸嚴(yán)重時(shí)可引起神經(jīng)系統(tǒng)損害甚至引起死亡。

中國人群G6PD基因突變以G1388A(G-A)、G1376T(G-T)和A95G(A-G)突變最為常見。廣元地區(qū)地處四川盆地北部，秦嶺以南，與陜西及甘肅接壤，從地理分布上來說屬于南方。氣候條件也偏南方，從本次檢測(cè)來看，廣元地區(qū)126例新生兒黃疸患兒中發(fā)生G6PD基因突變31例，發(fā)病率為24.6%，突變以G1388A(G-A)為主，共23例，占基因突變比為74.2%(23/31)，而G1376T(G-T)和A95G(A-G)突變各占12.9%。本資料顯示廣元地區(qū)新生兒患G6PD缺乏癥者多數(shù)為G1388A(G-A)突變，亦屬于G6PD缺乏癥高發(fā)地區(qū)，與重慶G6PD基因突變稍有不同[10]，可能是由于本資料樣本量少，且本資料因試劑問題未涉及其他稀有突變類型，故實(shí)際G6PD缺陷發(fā)生率應(yīng)高于本次的檢測(cè)值。

熒光斑點(diǎn)法能100%檢出G6PD活性正常或者重度缺乏者，但會(huì)遺漏相當(dāng)大比例的部分缺乏女性病例，對(duì)雜合子檢出率不足；G6PD酶活性測(cè)定法應(yīng)用G6PD/6PDG是臨床確定G6PD性價(jià)比最優(yōu)的方法；本資料顯示熒光斑點(diǎn)法檢測(cè)陽性率為26.98%，而酶活性測(cè)定陽性率為24.60%，熒光斑點(diǎn)法出現(xiàn)了3例假陽性，可能原因是血片室溫和高溫保存能使G6PD酶活性降低[11]。而對(duì)G6PD/6PDG測(cè)定確診為G6PD缺陷的病例進(jìn)行基因檢測(cè)，能進(jìn)一步確診女性缺乏者屬于半合子還是純合子，為臨床診治提供更強(qiáng)有力的依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.058

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