楊 悅，宋志偉，韓 麗，馬學華，李秋平，馮磊光(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，哈爾濱 150001)

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·論 著·

首發(fā)精神分裂癥患者外周血Reelin基因甲基化檢測

楊 悅，宋志偉，韓 麗，馬學華，李秋平，馮磊光△
(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，哈爾濱 150001)

目的 通過精神分裂癥患者外周血中Reelin基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)的研究，探討DNA甲基化與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)。方法 收集精神分裂癥患者76例(患者組)和健康對照者60例(健康對照組)，采用甲基化特異性PCR方法檢測Reelin基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)。結(jié)果 患者組甲基化陽性率為78.95%(60例)，健康對照組甲基化陽性率為35%(21例)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.971，P=0.026)；Logistic回歸分析顯示，Reelin基因甲基化與精神分裂癥有關(guān)(OR=13.084，95%CI：5.079～26.308)。結(jié)論Reelin基因啟動子區(qū)DNA甲基化與精神分裂癥有關(guān)，精神分裂癥患者外周血中Reelin基因啟動子區(qū)DNA呈超甲基化狀態(tài)，Reelin基因DNA甲基化是精神分裂癥的危險因素。

精神分裂癥；Reelin基因；DNA甲基化

Reelin是一種由γ-氨基丁酸能神經(jīng)元分泌的一種細胞外基質(zhì)糖蛋白，參與神經(jīng)傳遞、信息形成和突觸可塑性的信號調(diào)節(jié)途徑，在腦發(fā)育過程中對神經(jīng)干細胞遷移和定位起調(diào)節(jié)作用。在成熟哺乳動物中，Reelin不僅存在于大腦，還存在于血液、肝臟等器官和組織[1]。研究證實Reelin與精神分裂癥密切相關(guān)，Reelin基因是精神分裂癥的風險基因，國外學者通過對精神分裂癥患者尸腦組織的研究發(fā)現(xiàn)多個腦區(qū)中Reelin基因的表達下降，這種降低可達到50%以上[2]，且外周血中Reelin蛋白表達降低[3]。有研究認為Reelin在精神分裂癥患者皮層中間神經(jīng)元中表達降低，可能和神經(jīng)元中選擇性DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶增高使Reelin啟動子過度甲基化有關(guān)[4]。另外對精神分裂癥患者基因組的研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化總體水平是降低的[5]。本研究檢測76例精神分裂癥患者和60例對照者外周靜脈血Reelin基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)，探討精神分裂癥與Reelin基因甲基化的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 首發(fā)精神分裂癥患者組來自于2013年9月至2014年10月就診于哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院精神科的住院患者，共入組76例患者，其中男32例、女44例，年齡18～58歲、平均(29.59±11.03)歲，病程(32.23±6.04)個月。患者組入組標準：(1)符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》(DSM-Ⅳ)精神分裂癥的診斷標準；(2)陽性和陰性癥狀量表(PANSS)總分大于60分；(3)首次發(fā)作，從未使用過精神類藥物；(4)漢族，年齡18～60歲?；颊呓M排除標準：排除患心、肝、腎、內(nèi)分泌、血液、風濕、消化系統(tǒng)等疾病及營養(yǎng)不良者；排除有煙草、酒精或其他精神活性物質(zhì)濫用史者。健康對照組為同期在本院體檢中心體檢者，共入組60例，其中男35例、女25例，年齡21～55歲、平均(27.78±10.91)歲。健康對照組入組標準：(1)無精神病及精神病家族史，PANSS總分不超過40分；(2)漢族，年齡18～60歲。健康對照組排除標準與患者組相同。且患者組與健康對照組性別及年齡相匹配。兩組在年齡和性別上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 PANSS量表評定 患者組在取血當天由兩名受過訓練的醫(yī)生完成PANSS量表評定，以評估癥狀嚴重程度。

1.2.2 標本的采集和處理 所有研究對象采集空腹靜脈血3.0 mL，放入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 Reelin基因啟動子區(qū)DNA甲基化檢測 采用甲基化特異性PCR(MS-PCR)方法。MS-PCR是一種特異位點甲基化檢測技術(shù)?；驹硎怯脕喠蛩釟溻c處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，用不同的引物進行PCR，即可將其區(qū)分，從而確定基因有無CpG島甲基化。血液基因組DNA提取系統(tǒng)(批號H6707)及熒光定量PCR試劑盒EP202(均購自天根公司)，嚴格按試劑盒說明書操作，從白細胞中提取基因組DNA。DNA甲基化試劑盒為德國ZYMO公司生產(chǎn)，所用引物[6]由黑龍江省哈爾濱市博士生物有限公司合成，引物序列見表1。用聚合酶鏈反應(yīng)熱循環(huán)儀(ABI7500)進行擴增。Reelin基因啟動子區(qū)DNA擴增，PCR反應(yīng)體系總體積25 μL：DNA模板2.5 μL，每個引物各1 μL，2×Mastermix 12.5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。Reelin啟動子區(qū)DNA甲基化擴增PCR反應(yīng)體系總體積20 μL：DNA模版4.0 μL，每個引物各1.0 μL，2×Mastermix 10 μL，ddH2O 4.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后觀察結(jié)果。

表1 Reelin 基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理 所有統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0完成。計數(shù)資料以率表示，組間比較用χ2檢驗；采用多因素Logistic回歸分析(Enter法)控制年齡和性別因素，分析Reelin基因甲基化與精神分裂癥的關(guān)系；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者組和健康對照組DNA甲基化情況 患者組甲基化陽性率為78.95%(60/76)，高于健康對照組的35.00%(21/60)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.971，P=0.026)。見表2。

表2 兩組甲基化陽性率的比較[n(%)]

2.2 性別對Reelin甲基化陽性率的影響 76例精神分裂癥患者中女性甲基化陽性率為86.36%(38/44)，高于男性的68.75%(22/32)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.500，P=0.034)。

2.3 危險因素分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示，Reelin啟動子區(qū)DNA甲基化與精神分裂癥發(fā)生有關(guān)(OR=13.084，P<0.01)。見表3。

表3 Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

精神性疾病已成為中國嚴重的公共衛(wèi)生和社會問題。至今精神分裂癥的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，一直是世界性醫(yī)學難題，這就要求人們從新的角度進一步闡明精神分裂癥的發(fā)病機制。越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳參與精神分裂癥的病理形成與發(fā)展。表觀遺傳主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾。DNA甲基化在個體發(fā)育過程當中起著至關(guān)重要的作用，是細胞、組織多樣化的重要分子機制之一 。

本研究采用亞硫酸鹽修飾、甲基化特異性的PCR和瓊脂糖凝膠電泳等實驗技術(shù)，初步證實Reelin啟動子區(qū)在精神分裂癥患者組和健康對照組的表達存在差異，結(jié)果提示在精神分裂癥患者組外周血中Reelin啟動子區(qū)發(fā)生甲基化者明顯多于健康對照組。這與Abdolmaleky等[6]研究精神分裂癥患者腦組織中Reelin啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)女性的甲基化率明顯高于男性的甲基化率，其主要原因可能與女性雌激素的分泌有關(guān)。

多個精神分裂癥風險基因的表達受DNA甲基化調(diào)控，如兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、絡(luò)絲蛋白(RELN)及谷氨酸脫羧酶(GAD1)[7-9]。但對于Reelin基因啟動子區(qū)的甲基化，不同學者的研究結(jié)果并不一致。如Grayson等[10]檢測精神分裂癥患者死后大腦枕葉及額皮質(zhì)中Reelin基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，相對于正常對照而言，CpG序列的-139和-134位置的胞嘧啶甲基化增加，該區(qū)域的DNA甲基化對于Reelin表達調(diào)控起重要作用；Abdolmaleky等[6]也發(fā)現(xiàn)Reelin基因CpG島超甲基化，其定位在精神分裂癥患者尸檢額前皮質(zhì)標本-139和-134的上游位置。然而，在Tamura等[11]對精神分裂癥患者和對照者腦組織Reelin基因甲基化狀態(tài)的研究中，未能重復以上的結(jié)果，只是在健康對照組檢測到Reelin基因的甲基化水平與其年齡呈正相關(guān)，精神分裂癥患者Reelin基因甲基化狀態(tài)與健康對照組沒有明顯的不同；Tochigi等[12]檢測15例精神分裂癥患者和15例健康對照的尸腦前額皮質(zhì)Reelin基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)，同樣沒有得出陽性結(jié)果。這些結(jié)果的差異表明DNA甲基化可能受到種族及其生活環(huán)境的影響，同時DNA甲基化總體水平的降低暗示著精神分裂癥患者的異常甲基化反應(yīng)通路。本研究檢測血液中Reelin基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)，結(jié)果表明Reelin基因啟動子區(qū)DNA甲基化與精神分裂癥發(fā)生有關(guān)，這一研究結(jié)果在精神分裂癥表觀遺傳改變方面可能是一個有意義的貢獻，為精神分裂癥中Reelin基因活動減退提供了一個分子學基礎(chǔ)，并且為精神分裂癥尋找潛在的外周血液標記物，以便對其有效防治提供新的靶點。

精神分裂癥不僅與基因遺傳因素有關(guān)，還與環(huán)境因素有關(guān)。表觀遺傳可能是環(huán)境因素在分子水平上的反映。表觀調(diào)控機制尤其是DNA甲基化用于精神分裂癥病因及發(fā)病機制的研究，將成為該病病因?qū)W研究的新途徑。

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Detection of peripheral blood Reelin gene methylation in patients with first-episode schizophrenia

YANGYue,SONGZhi-wei,HANLi,MAXue-hua,LIQiu-ping,FENGLei-guang△
(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,Heilongjiang150001,China)

Objective To study the relationship between DNA methylation with schizophrenia by investigating the DNA methylation status of peripheral blood Reelin gene promoter in the patients with schizophrenia.Methods The Reelin gene promoter DNA methylation was measured in 76 patients with schizophrenia(patients group) and 60 healthy controls(healthy control group) by adopting methylation-specific PCR.Results The methylation positive rate in the patients group was 78.95%(60 cases),which in the healthy control group was 35%(21 cases),the difference was statistically significant(χ2=4.971,P=0.026); the Logistic regression analysis showed that the Reelin gene methylation was correlated with schizophrenia(OR=13.084，95%CI：5.079-26.308).Conclusion The Reelin gene promoter DNA methylation is associated with schizophrenia,and the peripheral blood Reelin gene promoter DNA methylation presents the supermethylation status in the patients with schizophrenia.Reelin gene DNA methylation is the risk factor for schizophrenia.

schizophrenia; Reelin gene; DNA methylation

楊悅，女，碩士在讀，主要從事分子生物化學研究。△

，E-mail:leiguangfeng@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.031

A

1672-9455(2015)22-3373-03

2015-03-28

2015-09-23)