羅陽剛，呂玉宇(.四川省宣漢縣人民醫(yī)院病理科 63650；2.重慶市第五人民醫(yī)院病理科 400062)

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·論 著·

HPVL1殼蛋白與P16蛋白聯(lián)合檢測在宮頸癌前病變中的臨床意義*

羅陽剛1，呂玉宇2△
(1.四川省宣漢縣人民醫(yī)院病理科 636150；2.重慶市第五人民醫(yī)院病理科 400062)

目的 研究HPVL1殼蛋白與P16蛋白聯(lián)合運用在宮頸癌前病變診斷中的臨床意義及對轉(zhuǎn)歸的預(yù)測價值。方法 對208例TCT異常且HR-HPV陽性的患者進(jìn)行宮頸活檢并根據(jù)病理結(jié)果分組，同時檢測其HPVL1殼蛋白和P16蛋白并根據(jù)兩種抗體表達(dá)情況分為4組，并對其中隨訪到的155例患者進(jìn)行HPV轉(zhuǎn)陰分析。 結(jié)果HPVL1殼蛋白和P16蛋白在不同級別宮頸組織中的表達(dá)均不同，CINⅠ組的L1殼蛋白陽性率高于其他CIN組(P<0.01)，≥CINⅢ組的P16蛋白陽性率高于其他3組(P<0.01)；隨訪病例中HPVL1殼蛋白(+)/P16蛋白(-)的轉(zhuǎn)陰率高,尤其在CINⅠ患者中該組高于其他幾組(P<0.05)。結(jié)論HPVL1殼蛋白與P16蛋白聯(lián)合檢測可成為診斷及預(yù)測宮頸病變的一個有效指標(biāo)。

宮頸癌前病變;HPVL1殼蛋白;P16

宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，病死率現(xiàn)已躍居婦科腫瘤之首[1]。早期診斷宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)是預(yù)防宮頸癌的重要手段。研究證實，宮頸癌和CIN主要是由高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)持續(xù)感染所引起，但只有10%左右的HPV感染者會發(fā)生宮頸上皮的不典型增生和癌變[2]?，F(xiàn)行的宮頸液基細(xì)胞學(xué)(TCT)聯(lián)合HPV檢測的篩查方法大大降低了浸潤癌的病死率，但同時也給臨床診斷和治療帶來了巨大困擾，致使部分CIN過度治療。因此，如何進(jìn)一步改善篩查方法，逐步將CIN患者分流，對宮頸癌及癌前病變的研究具有重要意義。

國內(nèi)外研究報道，在CIN中P16蛋白與HR-HPV相關(guān)且隨病變級別增高表達(dá)增強[3]，HPV L1殼蛋白與HPV早期感染相關(guān)而消失于病毒整合到宿主DNA以后[4]。本研究選用HPV L1殼蛋白和P16蛋白作為早期診斷宮頸癌前病變的輔助指標(biāo)，結(jié)合TCT和HR-HPV檢測，通過隨訪研究宮頸病變患者的HR-HPV轉(zhuǎn)陰率以期能更準(zhǔn)確地預(yù)測CIN的生物學(xué)行為及其可能的進(jìn)展,探索更加合理、有效診斷處理CIN的方案，指導(dǎo)臨床醫(yī)師對其進(jìn)行個性化治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇重慶市第五人民醫(yī)院2012年9月至2014年2月TCT異常且HR-HPV檢測陽性的婦女208例，年齡23～77歲，平均(49±7)歲，所有研究對象均行宮頸活檢，以病理結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)對初次檢查結(jié)果行對照研究，分為慢性炎癥組72例，CINⅠ組61例，CINⅡ組36例，CINⅢ+癌組39例。隨后記錄6～24個月間隨訪到的155例研究對象的HR-HPV復(fù)查結(jié)果，包括進(jìn)行治療[抗病毒藥物和(或)手術(shù)治療]和未治療(觀察隨訪)的所有病例，其中慢性炎癥組65例(2例治療，44例未治療)，CINⅠ組49例(15例治療，34例未治療)，CINⅡ組18例(18例均治療)，CINⅢ+癌組23例(23例均治療)；最后根據(jù)前期活檢標(biāo)本HPV L1 殼蛋白及P16蛋白表達(dá)情況分為4組，即HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(-)、HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(+)、HPV L1殼蛋白(-)/P16蛋白(+)、HPV L1殼蛋白(-)/P16蛋白(-)，分析比較各級別CIN患者HR-HPV轉(zhuǎn)歸情況。入選病例均有性生活史，無子宮切除史或者宮頸手術(shù)史，無激素及免疫抑制治療史，非妊娠婦女。所有病例按照規(guī)范流程行病理學(xué)診斷，均由2位病理醫(yī)師確診。

1.2 方法

1.2.1 HPV檢測 利用德國QIAGEN公司的第二代雜交捕獲法(HC-2) 采用全長8 000個堿基對的RNA混合雞尾酒探針，利用核酸雜交和化學(xué)發(fā)光信號放大法，檢測WHO確定的14種HR-HPV。采用儀器判讀，當(dāng)檢測值不低于1.0 pg/mL即為陽性。

1.2.2 HPV L1殼蛋白檢測 采用賽泰-細(xì)胞/組織HPV染色試劑盒(美國愛迪旺斯醫(yī)療科技有限公司)，本試劑能夠識別28型宮頸癌相關(guān)HPV亞型的HPV L1殼蛋白，包括6、11、16、18、31、33、45 和58 型等。按試劑說明書逐步操作：HE切片處理好后待自然風(fēng)干，逐步經(jīng)過梯度乙醇和蒸餾水分別濕潤玻片，檸檬酸漂洗，加入HPV L1、抗體、二抗，并行雜交后RNA酶及免疫組化染色，封片診斷。

1.2.3 P16蛋白檢測 單抗p16INK4a(Gene，克隆號5B10)免疫組織化學(xué)染色?？乖?jīng)高壓鍋高溫修復(fù)，免疫組化按二步法操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，復(fù)染，封片。病變細(xì)胞核伴(或)細(xì)胞質(zhì)著色。每批染色均設(shè)陽性及陰性對照片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料以率表示，各組間的比較采用χ2檢驗或 Fisher精確檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組宮頸病變組織中HPV L1殼蛋白和P16蛋白的表達(dá)情況 比較各組HPV L1殼蛋白表達(dá)情況，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.118，P<0.01)。CINⅠ組的L1殼蛋白陽性率大于CINⅡ組(χ2=15.771，P<0.01)及CINⅢ+癌組(χ2=26.394，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；慢性炎癥組的L1殼蛋白陽性率大于CINⅠ組(χ2=10.231，P<0.05)及CINⅢ+癌組(χ2=7.843，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而其他幾組的L1殼蛋白陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。比較各組P16蛋白表達(dá)情況，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=112.152，P<0.01)。CINⅢ+癌組的P16蛋白陽性率高于慢性炎癥組(χ2=104.601，P<0.01)、CINⅠ組(χ2=42.779，P<0.01)及CINⅡ(χ2=13.139，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1、2和表1。

2.2 155例患者隨訪情況 本研究中慢性炎癥患者P16蛋白均為陰性， L1殼蛋白(+)和L1殼蛋白(-)的HPV轉(zhuǎn)陰率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.314)；治療組L1殼蛋白(+)和L1殼蛋白(-)的HPV轉(zhuǎn)陰率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.855)；未治療組L1殼蛋白(+)和L1殼蛋白(-)的HPV轉(zhuǎn)陰率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.212)；L1殼蛋白(+)的治療組與未治療組HPV轉(zhuǎn)陰率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.920)；L1殼蛋白(-)的治療組與未治療組HPV 轉(zhuǎn)陰率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.245)，見表2。

圖1 慢性宮頸炎 HPV L1殼蛋白(+)(免疫組化，×200)

圖2 CINⅢ P16蛋白(+)(免疫組化，×400)

組別nHPVL1殼蛋白+-陽性率(%)P16蛋白+-陽性率(%)慢性炎癥72264636．11ab0720．00eCINⅠ61392263．93ad18439．51eCINⅡ3682822．22abc231363．89eCINⅢ+癌3943510．26abd38197．43e

注： HPV L1殼蛋白各組間比較，aP<0.05；與CINⅠ比較，bP<0.05；與慢性炎癥組比較，cP>0.05；與其他各組比較，dP<0.05。P16蛋白各組間比較，eP<0.01。

表2 隨訪慢性炎癥組[抗病毒藥物和(或)手術(shù)治療]65例患者的HR-HPV 轉(zhuǎn)歸情況

注：與同組內(nèi)L1殼蛋白(-)比較，aP>0.05；與未治療組相比，bP>0.05。

比較CINⅠ患者各組間HPV轉(zhuǎn)陰率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.814，P=0.02)。HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(-)的轉(zhuǎn)陰率高于其他幾組，與HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(+)、HPV L1殼蛋白(-)/P16蛋白(+)比較均是P=0.042，與HPV L1殼蛋白(-)/P16蛋白(-)比較P=0.031，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；而其他幾組的HPV轉(zhuǎn)陰率之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.954)。比較各組內(nèi)手術(shù)患者與未手術(shù)患者的轉(zhuǎn)陰率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(-)、HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(+)、HPV L1殼蛋白(-)/P16蛋白(+)、HPV L1殼蛋白(-)/P16蛋白(-)4組中的手術(shù)患者轉(zhuǎn)陰率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.387)，但這4組中未手術(shù)患者的轉(zhuǎn)陰率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.434，P=0.038)。見表3。

由于CINⅡ組和CINⅢ+癌組隨訪到的患者均行手術(shù)治療且例數(shù)較少，兩者合并為高級別CIN+癌組，暫未行統(tǒng)計差異分析，但表4顯示，各組術(shù)后HR-HPV轉(zhuǎn)陰率有明顯差異，HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(-)的患者轉(zhuǎn)陰率較高。

表3 隨訪CINⅠ組49例患者的HR-HPV轉(zhuǎn)歸情況

表4 隨訪高級別CIN+癌組41例患者術(shù)后HR-HPV轉(zhuǎn)歸情況

3 討 論

宮頸細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HR-HPV病毒檢測提高了早期宮頸癌和癌前病變的檢出率，但并不是所有的CIN都進(jìn)展為癌[5]，有研究顯示CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ發(fā)展的概率分別是15%、30%、45%，持續(xù)的概率分別是32%、35%、56%，消退的概率分別是57%、43%、32%[6]。因此，評價HPV感染和CIN進(jìn)展的危險性是處理宮頸癌前病變的一個重要依據(jù)，本課題通過對隨訪患者HR-HPV轉(zhuǎn)陰率的研究，力求探尋一種可以將宮頸病變中有潛在發(fā)展或有自愈可能的病例分開的方法，以達(dá)到對疾病分流、對患者進(jìn)行個性化治療的目的。

HPV L1殼蛋白是一種由HPV基因組LR區(qū)編碼的核蛋白，表達(dá)于所有亞型的HPV病毒。HPV可長期存在于基底層細(xì)胞內(nèi)，L1殼蛋白的合成與鱗狀上皮的成熟過程有關(guān)，其在病毒顆粒完成復(fù)制后高表達(dá)于表層細(xì)胞；但在病毒DNA整合到宿主細(xì)胞以后逐漸消失[4]，有人將這解釋為L1基因啟動子的隔離作用使L1殼蛋白表達(dá)缺失[6]。同時，HPV L1殼蛋白是保護性抗原，能誘發(fā)機體的免疫反應(yīng)使局部形成高濃度的免疫抗體，當(dāng)感染細(xì)胞的HPV L1數(shù)量快速減少時可能發(fā)生免疫逃逸，造成CIN細(xì)胞逃脫機體免疫監(jiān)視及清除，若免疫缺失持續(xù)存在可導(dǎo)致CIN細(xì)胞異常增殖發(fā)展成癌[7]。有研究提出HPV L1殼蛋白表達(dá)缺失是HPV相關(guān)惡性轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)[8]。在HR-HPV基因中存在L1殼蛋白變異體，不能組裝成成熟的病毒顆粒，導(dǎo)致細(xì)胞中大量的病毒DNA復(fù)制整合進(jìn)入宿主細(xì)胞，感染細(xì)胞失控性增殖而惡性轉(zhuǎn)化[9]。國內(nèi)外研究顯示，低級別CIN表達(dá)L1殼蛋白，隨著宮頸病變級別的增高其表達(dá)率呈下降趨勢，在大多數(shù)高級別CIN及癌不表達(dá)[10-12]。本研究結(jié)果表明，隨著細(xì)胞異型性及病變程度的加重，CINⅠ中L1殼蛋白的表達(dá)率高于CINⅡ(P<0.01)、CINⅢ+癌(P<0.01)。因此，可以通過檢測HPV L1殼蛋白表達(dá)分析HPV與宿主基因的整合情況，其結(jié)果為HPV L1殼蛋白可預(yù)測CIN的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸提供了有力依據(jù)。

P16基因又稱為多腫瘤抑癌基因，在多種原發(fā)性腫瘤中表達(dá)缺失，相反在宮頸癌及CIN中出現(xiàn)過度表達(dá)。P16蛋白過度表達(dá)可能與HPV持續(xù)感染有關(guān)，已經(jīng)證實一過性HPV感染不會出現(xiàn)P16過表達(dá)現(xiàn)象。在宮頸癌及癌前病變中存在P16-cyclinD-CDK4-pRB精細(xì)調(diào)節(jié)級聯(lián)，pRB-E2F復(fù)合物負(fù)反饋抑制P16的轉(zhuǎn)錄和翻譯[13]。當(dāng)HPV整合進(jìn)入宿主細(xì)胞后，E7癌蛋白競爭性抑制CDK4與pRB蛋白結(jié)合，使pRB蛋白失活，P16失去負(fù)反饋抑制，激活了E2F使其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平相應(yīng)提高，從而導(dǎo)致P16的過表達(dá)，意味著細(xì)胞已被啟動了癌變的程序[14]。此外，也有學(xué)者推測在腫瘤發(fā)生中可能存在非HPV依賴的P16蛋白調(diào)節(jié)機制。本研究結(jié)果顯示，不同級別宮頸病變中P16蛋白陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，CINⅢ以上的病變中高表達(dá)，在炎癥及CINⅠ中低表達(dá)。不同學(xué)者的研究均顯示P16蛋白與宮頸癌和CIN病變程度及進(jìn)展有關(guān)[3]。因此，作者認(rèn)為P16 蛋白可作為宮頸高級別病變的輔助標(biāo)志物。

HPV L1殼蛋白表達(dá)于宮頸低級別病變，隨著病變進(jìn)展，表達(dá)逐漸下降至缺失，而P16蛋白表達(dá)則呈增強趨勢，HPV L1殼蛋白與P16蛋白聯(lián)合檢測將更有助于判斷宮頸病變的進(jìn)展程度。本研究對宮頸組織中HPV L1/P16著色方式分組隨訪，其結(jié)果顯示：HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(-) CINⅠ患者其病毒轉(zhuǎn)陰率高于其他三組，該組病毒雖然處于復(fù)制狀態(tài)但未整合進(jìn)入宿主基因組，機體仍具有相應(yīng)的免疫反應(yīng)且pRB通路正常運行，能誘發(fā)機體的免疫反應(yīng)而清除病毒，可被認(rèn)為是低危型組，提示HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(-)時病變有自愈的可能；而HPV L1殼蛋白(-)/P16蛋白(+)組HPV病毒已處于整合狀態(tài)，pRB通路被抑制而沒有相應(yīng)的免疫反應(yīng)，高級別CIN中此組HPV轉(zhuǎn)陰率最低，可被認(rèn)為是高危型組，必須提高警惕，必要時行陰道鏡檢查并行活檢以明確診斷，防止漏診；HPV L1殼蛋白(-)/P16蛋白(-)和HPV L1殼蛋白(+)/P16蛋白(+)為不確定型組，建議患者定期隨訪。本研究比較了炎癥到CIN病變的轉(zhuǎn)陰率后可以看出，HPV L1殼蛋白和P16蛋白聯(lián)合運用在CIN病變尤其是CINⅠ中起到了有效的分流作用，而在炎癥患者未見明顯指導(dǎo)意義。

目前關(guān)于HPV L1殼蛋白與P16基因有較多的基礎(chǔ)和臨床研究，結(jié)論一致認(rèn)為兩者與宮頸癌及癌前病變的相關(guān)性，并且已經(jīng)探明部分發(fā)生機制，但缺乏大量隨訪研究。本課題以宮頸組織形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，通過隨訪CIN患者的HR-HPV轉(zhuǎn)陰率，將HPV L1殼蛋白與P16蛋白聯(lián)合檢測應(yīng)用于CINⅠ患者的分流，為其成為診斷及預(yù)測宮頸病變的有效指標(biāo)提供了循證醫(yī)學(xué)所必需的臨床流行病學(xué)及統(tǒng)計學(xué)資料，值得未來長期大樣本隨訪加以深入研究。

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Clinical significance of combined detection of HPV L1 capsid protein and P16 protein in cervical precancerous lesion*

LUOYang-gang1,LYUYu-yu2△
(1.DepartmentofPathology,XuanhanCountyPeople′sHospital,Xuanhan,Sichuan636150,China;2.DepartmentofPathology,ChongqingMunicipalFifthPeople′sHospital,Chongqing400062,China)

Objective To evaluate the clinical significance of the combination detection of human papillomavirus(HPV) L1 capsid protein and p16 protein in the diagnosis of cervical precancerous lesion and its predictive value to disease outcome.Methods 208 cases of abnormal in thinprep cytologic test and high risk(HR)-HPV positive were performed the cervical biopsy and grouped according to the histopathologic test.Meanwhile,these cases were detected the HPV L1 capsid protein and the p16 protein and then divided into 4 groups according to the expression situation of these two kinds of antibody.Among them,155 followed up cases were performed the analysis of HPV negative conversion.Results The expression of L1 and P16 was different among different grades of cervical tissues,the positive rate of L1 in the cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅰ group was higher than that of other CIN groups(P<0.01) and the positive rate of P16 in the ≥CINⅢ group was higher than that in the other 3 groups(P<0.01).Among the follow-up cases,the negative conversion rate in the HPV L1(+)/P16(-) was higher,especially which in the CINⅠgroup was higher than other groups(P<0.05).Conclusion The combined detection of HPV L1 capsid protein and P16 protein can be used as an effective indicator in the diagnosis and prediction of cervical lesions.

cervical intraepithelial neoplasia; HPV L1 capsid protein; P16 protein

重慶市衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)學(xué)科研資助項目(20142170)；重慶市南岸區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)學(xué)科研資助項目。

羅陽剛，男，主治醫(yī)師，大專，主要從事女性生殖系統(tǒng)臨床病理診斷?！?/p>

，E-mail：lvyuu@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.009

A

1672-9455(2015)22-3314-04

2015-03-22

2015-08-31)