林國葉,謝志平(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院骨科，福州 351100)

?

·論 著·

實時熒光定量PCR技術診斷人骨肉瘤MG63細胞系中β-catenin基因表達的臨床分析*

林國葉,謝志平
(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院骨科，福州 351100)

目的 分析實時熒光定量PCR技術(FQ-PCR)診斷人骨肉瘤MG63細胞系中β-catenin基因表達。方法 培養(yǎng)人骨肉瘤MG63細胞系，對其進行分組，對照組細胞使用10%的胎牛血清以及含有青霉素和鏈霉素的DEME高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。而刺激組則在此基礎上用100ng/mL的wnt3a細胞進行培養(yǎng)。分別在第0、1、2、3、4天分別采集3個孔的細胞，采用細胞消化的方式計算細胞個數(shù)，采用FQ-PCR檢測人骨肉瘤MG63細胞系中β-catenin基因表達。結果 在細胞生長的第0、1天，兩組MG細胞數(shù)量對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而在第2、3、4天兩組的細胞個數(shù)對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。β-catenin基因表達與wnt3a的蛋白刺激濃度呈非正相關關系，在各個濃度中，以100ng/mL的wnt3a蛋白刺激β-catenin基因表達最高，其他幾個濃度的β-catenin基因表達對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。100ng/mL的wnt3a蛋白刺激在培養(yǎng)6h時β-catenin基因表達最高，并且在6h前，β-catenin基因表達會隨時間延長而增加。6h后β-catenin基因表達對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論FQ-PCR能夠反映人骨肉瘤MG63細胞中β-catenin基因表達。

人骨肉瘤細胞；β-catenin； 實時熒光定量PCR技術

在兒童和青少年人群中，骨肉瘤是最常見的骨腫瘤之一[1]。本文主要是探討利用實時熒光定量PCR技術(FQ-PCR)技術診斷人骨肉瘤MG63細胞中β-catenin的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人骨肉瘤細胞株MG63(中國科學院上海生物細胞研究所提供)、10%胎牛血清(上海泛柯實業(yè)有限公司購買，北美血源)、 青霉素(成都力思特制藥股份有限公司生產(chǎn))、鏈霉素(瑞陽制藥有限公司生產(chǎn))、DMEM高糖培養(yǎng)基(購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)、胰蛋白酶(購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)及自制的磷酸鹽緩沖液(PBS)。wnt3a蛋白干粉(購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)，熒光定量PCR試劑盒(購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)及β-catenin(購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)和GAPDH引物(引物序列F：5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′；R：5′-GGG GTC GTT GAT GGC AAC A-3′,購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.2 儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機，超潔凈工作臺，ABI Prism 7500 型熒光定量PCR儀以及倒置顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 人骨肉瘤MG63細胞系培養(yǎng) 將MG63細胞接種在48孔板中，對照組細胞使用10%的胎牛血清及含有青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。而刺激組則在此基礎上用100 ng/mL的wnt3a細胞培養(yǎng)進行培養(yǎng)。分別在第0、1、2、3、4天分別采集3個孔的細胞，采用細胞消化的方式計算細胞個數(shù)。觀察加入wnt3a蛋白刺激液的刺激組及沒有加入wnt3a蛋白刺激液的對照組MG63細胞的增殖情況。

1.3.2 不同濃度的wnt3a蛋白刺激人骨肉瘤MG63細胞 將wnt3a母液分別稀釋成濃度為0、50、100、150、200 ng/mL的wnt3a蛋白溶液，加入已經(jīng)接種了MG63細胞傳代的6孔板中，每個孔大約有4×105個細胞。所有的MG63細胞均在37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并且細胞貼壁24 h后才會加入不同濃度的wnt3a蛋白溶液刺激細胞24 h。

1.3.3 觀察β-catenin基因表達情況 所有細胞增殖結果觀察均采用FQ-PCR測定β-catenin基因表達情況。根據(jù)目的基因β-catenin和內參基因有相似的擴增效率，根據(jù)Licak公式可以計算得到目的基因β-catenin的相對表達量。

2 結 果

2.1wnt3a蛋白刺激液MG63細胞增殖 在細胞生長的第0、1天刺激組和對照組的MG細胞數(shù)量對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而在第2、3、4天兩組的細胞個數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 不同濃度的wnt3a蛋白刺激人骨肉瘤MG63細胞基因表達β-catenin基因表達與wnt3a的蛋白刺激濃度呈非正相關關系，β-catenin基因表達不會因為wnt3a濃度的增加而增加。在各個濃度中，以100ng/mL的wnt3a蛋白刺激β-catenin基因表達最高，其他幾個濃度的β-catenin基因表達對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 100mg/mL濃度不同時間段的β-catenin基因表達情況 表3結果顯示，在100mg/mL的wnt3a蛋白刺激在培養(yǎng)6h時β-catenin基因表達最高，并且在6h前β-catenin基因表達會隨時間延長而增加，6h后β-catenin基因表達對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 刺激組和對照組MG63細胞增殖比較±s，×105)

表2 不同濃度的wnt3a蛋白刺激人骨肉瘤MG63細胞β-catenin基因表達

表3 100 mg/mL濃度不同時間段的β-catenin基因表達情況

3 討 論

骨肉瘤主要在好發(fā)在長管狀骨的干骺端，并且可以在數(shù)個月后轉移肺部，呼吸衰竭是導致骨肉瘤患者死亡的主要原因[2-4]。目前對于骨肉瘤已經(jīng)有完善的放療和化療方案，骨肉瘤患者生存率有明顯提高。限制骨肉瘤患者長期生存率的兩大因素是肺轉移及骨腫瘤復發(fā)[5]。生物學研究結果揭示，Wnt/β-catenin信號通道是細胞增殖以及分化的關鍵環(huán)節(jié)[6-8]。多項結果證實，Wnt信號在骨細胞中，特別是對骨腫瘤細胞的生長、集落和遷移能力有明顯的抑制[9]。Wnt蛋白主要是和Frjz-zled細胞表面受體結合后激活GSK3的信號通路，從而GSK3可以和β-catenin相結合，使得β-catenin的降級被抑制，激發(fā)細胞增殖的信號通道[10]。

本文進行人骨肉瘤MG63細胞培養(yǎng)，觀察加入wnt3a蛋白刺激液的刺激組以及沒有加入wnt3a蛋白刺激液的對照組MG63細胞的增殖情況。在細胞生長的第0、1天刺激組和對照組的MG細胞數(shù)量對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而在第2、3、4天兩組的細胞個數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

本文的研究結果顯示，β-catenin基因表達與wnt3a的蛋白刺激濃度呈非正相關關系，β-catenin基因表達不會因為wnt3a濃度的增加而增加。并且進一步的研究發(fā)現(xiàn)用濃度為100ng/mL的wnt3a蛋白刺激β-catenin基因表達最高，加入wnt3a蛋白刺激液的MG63細胞明顯出現(xiàn)增長。本文是采用FQ-PCR技術進行檢測診斷，該技術可檢測到細胞內β-catenin基因的表達，并且其擴增效率及靈敏度高等，可以在較為寬廣的范圍內進行準確定量。從本研究結果中可以發(fā)現(xiàn)，Wnt3a蛋白刺激β-catenin基因在MG63細胞中的表達和時間的關系，在培養(yǎng)6h前，β-catenin基因表達量與時間呈正比，而超過6h后β-catenin基因表達結果對比差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，F(xiàn)Q-PCR能夠反映人骨肉瘤MG63細胞中β-catenin基因表達，研究wnt3a通道與人骨肉瘤MG63細胞中β-catenin基因表達的關系對于骨肉瘤細胞的表達以及轉移等方面的研究有著重要的指導意義。

[1]曲紹政.實時熒光定量PCR法檢測人骨肉瘤MG63細胞系中β-catenin基因的表達[D].青島：青島大學,2013.

[2]胡旭昌,王栓科,康學文，等.吉西他濱對人骨肉瘤細胞增殖及腫瘤轉移相關基因1mRNA表達的影響[J].中國全科醫(yī)學,2013,16(29):3450-3452.

[3]張帆.RNA干擾β-catenin基因對人骨肉瘤MG63細胞系生物學行為的影響和機制研究[D].武漢：華中科技大學,2011.

[4]衛(wèi)佳,陳英華,吳麗美，等.人S100A6對人骨肉瘤細胞系β-catenin的作用[J].基礎醫(yī)學與臨床,2009,29(11):1144-1149.

[5]于明東,李書忠.實時熒光定量PCR法檢測人骨肉瘤耐MTX細胞系中RFC、DHFR、GST-π的mRNA表達[J].中國矯形外科雜志,2009,17(11):858-861.

[6]張鵬,李書忠,張金鋒，等.WIF-1對人骨肉瘤MG-63細胞中β-catenin表達的作用研究[J/CD].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版,2013,7(21):115-118.

[7]覃莉,林陽,陳文堅，等.肺癌抑癌基因1對人骨肉瘤細胞株MG63生長和增殖的影響[J].中華實驗外科雜志,2013,30(8):1704-1706.

[8]吳德明,楊志強,劉翔，等.RNAi沉默Notch1基因對人骨肉瘤細胞MG63的促凋亡作用[J].山東醫(yī)藥,2013,53(4):36-38.

[9]覃莉,林陽,楊開祥，等.穩(wěn)定表達TSLC1基因骨肉瘤MG63細胞系的建立及鑒定[J].骨科,2013,4(2):66-68.

[10]李麗華,李梅,趙華福，等.miR-133amimics對骨肉瘤細胞系MG63增殖和凋亡作用的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2013,13(10):1869-1872.

Clinical analysis on real time FQ-PCR technique for diagnosing β-catenin gene expression in human osteosarcoma MG63 cell line*

LINGuo-ye,XIEZhi-ping
(DepartmentofOrthopedics,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion,Fuzhou,Fujian351100,China)

Objective To analyze the real time FQ-PCR technique for diagnosing β-catenin gene expression in human osteosarcoma MG63 cell line.Methods Human osteosarcoma cell line MG63 was cultured and grouped.The control group used 10% fetal bovine serum and the culture medium containing high glucose DEME penicillin and streptomycin.On this basis the stimulation group was cultured by using 100ng/mL wnt3a cell culture.The cells in 3 holes were collected on 0,1,2,3,4 d respectively and the cells number was counted by adopting the cell digestion way.FQ-PCR was adopted to detect the β-catenin gene expression in human osteosarcoma cell line MG63.Results On 0,1 d of the cell growth,the MG cells number had no statistical difference between the two groups; while which on 2,3,4 d had statistically significant differences between the two groups(P<0.05).The β-catenin gene expression showed a non-positive correlation with the stimulation concentration of wnt3 protein,in various concentrations,the β-catenin gene expression stimulated by 100 ng/mL wnt3a protein was highest,the differences in the β-catenin gene expression had no statistical difference among other concentrations(P>0.05).The β-catenin gene expression stimulated by 100 ng/mL wnt3a protein for 6 h culture reached highest,moreover before 6 h,the β-catenin gene expression was increased with time lapse.The β-catenin gene expression after 6 h had no statistical difference(P>0.05).Conclusion FQ-PCR can reflect the β-catenin gene expression in human osteosarcoma MG63 cells.

human osteosarcoma; β-catenin; FQ-PCR

福建省自然科學基金資助項目(2012J01410)。

林國葉，女，副主任醫(yī)師，本科，主要從事骨科研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.006

A

1672-9455(2015)22-3307-02

2015-04-08

2015-09-20)