王海峰，張 娜，王遵敬

(1.林口縣人民醫(yī)院眼科,黑龍江 林口 157600；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科，黑龍江 哈爾濱 150007；3、牡丹江市第二人民醫(yī)院眼科，黑龍江 牡丹江 157000)

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一個常染色體顯性遺傳性先天性白內(nèi)障家系分析①

目的：對1個常染色體顯性遺傳性先天性白內(nèi)障家系進行基因突變熱點的篩查，以探索其潛在的遺傳學缺陷。方法：經(jīng)過詳細的病史采集及完善的眼科學檢查后，對1個家系共10名成員(包括患者，非患者)抽取外周血提取基因組DNA，針對國內(nèi)外文獻報道的與常染色體顯性遺傳先天性白內(nèi)障發(fā)病相關的10個基因設計引物，PCR擴增后直接測序進行候選基因的突變檢測。結(jié)果：被檢查者的10個發(fā)病相關基因序列中，CRYBA4基因第四個外顯子上c.281T>C突變，并由此導致了βA4晶狀體蛋白第94位的苯丙氨酸被絲氨酸取代，其余9個與GenBank發(fā)表的正常序列相同。結(jié)論：CRYBA4基因外顯子上發(fā)現(xiàn)的已經(jīng)報道過的雜合型突變位點，可能是這個家系的致病基因，其對先天性白內(nèi)障的作用需進一步研究。

先天性白內(nèi)障；常染色體顯性遺傳；基因突變；序列分析

先天性白內(nèi)障是由于晶狀體在胚胎發(fā)育過程中代謝異常而導致透明度下降的疾病，是一種嚴重的致盲性晶狀體疾病。遺傳性先天性白內(nèi)障可以只表現(xiàn)為晶狀體的單一混濁，也可伴發(fā)眼部及其他系統(tǒng)的先天性異常。其遺傳方式有三種，既常染色體顯性、常染色體隱性及X連鎖隱性遺傳，其中以常染色體顯性先天性白內(nèi)障最為常見。研究顯示任何參與、影響晶狀體發(fā)育的基因突變都可能導致先天性白內(nèi)障的發(fā)生。目前約有60個致病位點被證明與先天性白內(nèi)障有關，有20多個基因檢測到了與先天性白內(nèi)障相關的突變，突變導致晶狀體結(jié)構(gòu)和代謝的異常，從而誘發(fā)白內(nèi)障的發(fā)生。這些基因包括晶狀體蛋白基因(主要包括α-晶體蛋白，β-晶體蛋白和γ-晶體蛋白，此外還有含量很少的ζ和μ晶狀體蛋白)、膜蛋白基因(主要包括縫隙連接通道蛋白GJA3和GJA8和主要內(nèi)源性蛋白MIP)、細胞骨架蛋白基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因(包括HSF4，MAF，PAX6 等)等。目前白內(nèi)障的發(fā)病機制尚未清楚，對其致病基因進行篩查是探索先天性白內(nèi)障發(fā)病內(nèi)在機制的重要手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為在哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)學院眼科確診的一個3代常染色體顯性遺傳先天性白內(nèi)障家系，共有成員10名，其中先天性白內(nèi)障患者3名，非白內(nèi)障患者5名，未確診患者2名。除了未確診患者其余所有的入選人員均在哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)學院接受全身及眼部檢查。

1.2 方法

對5名家系成員(患者3名，非患者2名)常規(guī)抽取外周血5ml,EDTA抗凝，用北京天根生物科技公司的血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA，稀釋至工作濃度后置于-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)Genbank中的10個基因的序列，應用PRIMER6.0設計引物，通過上海生工生物公司合成，以基因組DNA為模板，通過PCR反應對目的片段進行擴增。使用Chromas查看測序峰圖，用LasergeneSeqMan及BLAST在線網(wǎng)站將擴增片段的測序結(jié)果與在線的數(shù)據(jù)庫中正常的序列比對。對異常的測序峰圖( 例如堿基的突變、缺失、插入等)進行重復實驗并且雙向測序驗證結(jié)果。

1.3 臨床表現(xiàn)

3代共10人，包括男4人，女6人，為典型的常染色體顯性遺傳。參與此次研究的家系成員抽取血樣5份，其中患者3份，正常成員2份?；疾〕蓡T均為出生后即存在的雙眼晶狀體混濁，影響視功能，隨年齡增長視力下降漸重。臨床檢查為核型白內(nèi)障。無其他眼部疾病及全身性疾病史。(見圖1)

圖1

1.4 序列分析

家系中3名患者CRYBA4基因的4號外顯子第281位發(fā)生了T→C的突變，從而導致了有CRYBA4編碼的蛋白第94位苯丙氨酸被絲氨酸所取代。該位點被polyphen2在線軟件預測為“possiblydamaging”，因此c.225G>T也可能具有一定的致病性(圖2)通過NCBIhomogene數(shù)據(jù)庫比對CRYBA4基因同源蛋白的氨基酸序列，我們發(fā)現(xiàn)CRYBA4基因第94個氨基酸 苯丙氨酸為高度保守的氨基酸序列，具體的比對見圖3。

圖2

圖3

2 討論

晶體蛋白是晶狀體中含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，占晶狀體內(nèi)溶解性蛋白質(zhì)的90%，是纖維細胞失去細胞核后，合成的穩(wěn)定的非再生的高濃度的晶狀體蛋白，介導了晶狀體高折射率，對晶狀體的透明性和屈光性起重要的作用。因此任何能改變蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，改變蛋白溶解度，使可溶性蛋白質(zhì)沉淀、析出均能介導白內(nèi)障的發(fā)生。通過對該先天性白內(nèi)障家系CRYBA4基因的篩查，我們檢測到該家系兩名患者的DNA中，位于CRYBA4基因外顯子上c.281T>C的突變，并由此導致了βA4晶狀體蛋白第94位的苯丙氨酸被絲氨酸取代，而在家系中其他正常成員和100名正常對照者的CRYBA4基因中并未發(fā)現(xiàn)該突變。從而，我們推測，位于CRYBA4第四外顯子上的c.281T>C突變與這個家系的患病有關。苯丙氨酸具有疏水性，但是絲氨酸具有親水性，此外苯丙氨酸屬于芳香族氨基酸，但是絲氨酸則是脂肪族氨基酸，因此二者的結(jié)構(gòu)和功能具有重大的差異。極性氨基酸絲氨酸，具有很強的親水性，易與周邊氨基酸形成大量的氫鍵，因而具有很強的綁定功能。因此絲氨酸代替苯丙氨酸后，能和磷酸骨架或周圍的氨基酸形成較多的氫鍵，影響蛋白的穩(wěn)定性或減少了與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合。這可能預示著該段區(qū)域的堿基改變在先天性白內(nèi)障的發(fā)病中起著重要作用。該家系患者第281位堿基C取代了T，導致CRYBA4蛋白第94位的苯丙氨酸被絲氨酸所取代。上述氨基酸的改變會使蛋白質(zhì)的正常的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生，破壞了該蛋白的穩(wěn)定性。由于晶體蛋白之間的相互作用，β-A4晶狀體蛋白的異常，也會導致其他蛋白的表達發(fā)生變化，這一系列的異變發(fā)生在晶狀體的發(fā)育過程中，最終不能形成正常規(guī)則排列的透明晶狀體，可能引起白內(nèi)障的發(fā)生。該突變位點在白內(nèi)障星晨個中作用需要進一步的動物實驗予以證實。

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The analysis of mutations in an Chinese family with congenital cataract

WANGHai-feng1,ZHANGNa2,WANGZun-jing3

(1. Ophthalmology Department, People’s Hospital in Linkou County, Linkou 157600, China; 2. Ophthalmology Department, the Second Affiliated Hospital of Haerbin Medical University, Haerbin 150007,China; 3. Ophthalmology Department, the Second People’s Hospital in Mudanjiang City, Mudanjiang 157000, China)

Objective: To identify mutations in an Chinese family with congenital cataract .Methods: Venous blood was collected from family members to extract DNA.Ten different genes were identified as the cause of autosomal congenital nuclear cataract,which were screened by PCR amplification and sequencing.Results: We identified a c.281T>C sequence change which led to an amino acid substitutions in the CRYBA4 induced protein in the three patients of this family, and did not detect in the other individuals.Conclusion: One mutation iss discovered, while further study is required to determine the effect of congenial cataract.

congrnital cataract;mutataion;sequence analysis

王海峰(1973～)男，黑龍江林口人，本科，副主任醫(yī)師。

王海峰1，張 娜2，王遵敬3

(1.林口縣人民醫(yī)院眼科,黑龍江 林口 157600；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科，黑龍江 哈爾濱 150007；3、牡丹江市第二人民醫(yī)院眼科，黑龍江 牡丹江 157000)

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B

1008-0104(2015)03-0153-02

2014-12-20)