那麗莎，劉夕琳，李 想，孫長海

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

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基于生物分子網(wǎng)絡(luò)的人參皂苷Rg1的生物效應(yīng)①

那麗莎，劉夕琳，李 想，孫長海

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：運用代謝組學(xué)及生物效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)方法研究人參皂苷Rg1的生物效應(yīng)的機制。方法：采用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合偏最小二乘判別分析方法，考察空白組與人參皂苷Rg1給藥組的內(nèi)源性物質(zhì)差異，并確定生物標志物。結(jié)果：篩選出對分組貢獻較大的25種潛在生物標記物，通過數(shù)據(jù)庫確定了6個目標物的結(jié)構(gòu)、代謝途徑，相關(guān)酶和作用靶點，分別為吡哆醛與醛氧化酶、氨基葡萄糖和己糖激酶、甲基尿酸及黃嘌呤脫氫酶、多巴醌轉(zhuǎn)化酪氨酸酶、氟尿苷與胸苷磷酸化酶、卵磷脂和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及文獻解釋了人參皂苷Rg1在嘧啶代謝通路中為胸苷磷酸化酶的抑制劑；還可促進卵磷脂通過血漿卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶催化成血漿膽固醇酯。結(jié)論：代謝組學(xué)及生物效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)方法能用于人參皂苷Rg1生物效應(yīng)機制的研究，為進一步揭示人參皂苷Rg1藥理作用機制提供了新方法。

人參皂苷Rg1；代謝組學(xué) ；生物效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)

三七為五加科植物[Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen]，是我國傳統(tǒng)的名貴藥材。人參皂苷Rg1(ginsenosideRg1)是三七的主要單體成分，也是臨床應(yīng)用的藥理活性成分。人參皂苷Rg1具有具有活躍的生物活性，抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)保護作用[1]。研究表明，人參皂苷Rg1可抑制腫瘤細胞蛋白質(zhì)合成、促進BGC-823細胞凋亡[2]；其影響Caspase-3、Bcl-2的表達，可對腦缺血再關(guān)注損傷有明顯保護作用[3]；可明顯抑制TF-1細胞的增值并促進其凋亡，對人白血病TF-1細胞EPOR信號通路具有影響[4]。但是，如何應(yīng)用生物分子網(wǎng)絡(luò)同時探索藥物多種生物效應(yīng)機制的方法尚未見報道。因此，本研究以代謝組學(xué)分析方法研究空白組與人參皂苷Rg1給藥組代謝差異，根據(jù)差異性代謝物結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)解釋其相關(guān)酶、靶點及代謝途徑，為闡明人參皂苷Rg1引起的多種生物效應(yīng)機制提供了新方法[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

①實驗動物：選擇清潔級Wistar雄性大鼠12只，體重(200±20)g，購自長春億斯實驗動物技術(shù)公司，許可證號：SCXK-(吉)2011-0004； ②儀器與試藥Agilent1200/6300型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；KQ-250DE臺式數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；人參皂苷Rg1標準品(大連美侖生物技術(shù)有限公司，CAS:22427-39-0)；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲酸(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；實驗室用水為自制三蒸水；

1.2 實驗方法

①實驗分組：將大鼠隨機分為空白組與人參皂苷Rg1給藥組。人參皂苷Rg1組以100mg·kg-1劑量隔日灌胃給藥一次，連續(xù)7d?？瞻捉M給予等量的生理鹽水。實驗前，每只大鼠眼眶取0.5mL空白血，實驗時，每只大鼠于1d,3d,5d,7d灌胃給藥1h后取血：取血0.5mL，靜置半小時，于3500r·min-1離心10min，分離血清，-80℃下保存。 ②血清的前處理：取100μL血清樣品，加入200μL甲醇，渦旋30s，于10000r·min-1離心10min，移取上清液，40℃N2流下吹干，殘渣用100μL甲醇復(fù)溶，渦旋30s后離心5min，取10μL上清液進樣。 ③實驗條件：色譜條件AgilentBC-C18柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；C18保護柱(5mm×2.1mm，1.7μm)；流動相:(A)0.1%甲酸+5%水+甲醇(B)0.1%甲酸+5%甲醇+水，梯度洗脫(初始0%A，100%B;20min，100%A，0%B;25min，100%A，0%B；30min，0%A，100%B) ；流速：0.6mL·min-1;柱溫：25℃；進樣量為10μL。質(zhì)譜條件 離子肼ESI源；正離子模式自動二級在m/z50～1000內(nèi)進行全掃描；毛細管電壓為13V，溫度為350℃；鞘氣(N2)流量為10mL·min-1；輔助氣(N2)流量為0.15mL·min-1；碰撞氣為He。

2 結(jié)果

2.1 給藥后大鼠血清總離子流圖

全掃描監(jiān)測的血清的總離子流圖(圖1)。圖1A為空白組，圖1B為給藥組，由圖可知，給予人參皂苷Rg1后引起大鼠血清明顯代謝差異。

圖1A 空白組

圖1B 人參皂苷Rg1給藥組

2.2 模式識別

利用MATLAB程序?qū)ιV峰平滑、對齊、匹配處理，提取碎片的質(zhì)荷比(50-1000)、保留時間、和相應(yīng)的峰強度(>10000)。將輸出的三維數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P12.0軟件進行中心化和Pareto均一化處理，然后以非監(jiān)督的主成分分析(PCA)，對大鼠血清進行模式識別分析[6]。血清樣本PCA得分圖2所示，1～6號為空白組，7～12號為人參皂苷Rg1給藥組，兩組區(qū)分明顯，說明人參皂苷Rg1影響大鼠體內(nèi)的代謝發(fā)生了明顯變化。

采用偏最小二乘判別分析方法(PLS-DA)，得出載荷圖3來篩選潛在生物標記物。通過選取VIP(Variableimportancefortheprojection)值并結(jié)合載荷矩陣圖來研究每一個變量的偏離程度，從而篩選目標物[7,8]。在載荷圖中，共有280個變量，偏離程度越大并且VIP值>1.5的點為對分組有顯著性貢獻的變量。如圖3，紅色的框標記出對分組有顯著性貢獻的變量，因此，選擇這些25個變量為生物標記物。

圖2 空白組與給藥組的PLS-DA得分圖

圖3 空白組與給藥組的PLS-DA載荷圖

2.3 生物標記物鑒定及生物效應(yīng)分析

根據(jù)提取生物標記物的分子離子峰，得到精確的質(zhì)荷比(m/z)，代入到ChEBI與HMDB數(shù)據(jù)庫中搜索可能的化合物，然后結(jié)合二級質(zhì)譜碎片裂解規(guī)律及參考文獻中的MS/MS標準譜圖進行比對，最后鑒定出6種目標物結(jié)構(gòu)，分別為吡哆醛m/z167.1、氨基葡萄糖m/a179.0、甲基尿酸m/z182.0、多巴醌m/z195.1，氟尿苷m/z246.2，卵磷脂m/z494.3。

采用KEGG網(wǎng)站及相關(guān)文獻分析目標物的相關(guān)酶，代謝途徑及相關(guān)疾病的生物效應(yīng)，見表1。

表1 生物標志物及其代謝通路

3 討論

人參皂苷Rg1是從三七中分離出的單體成分，具有活躍的生物活性，其對心血管系統(tǒng)[9]、免疫系統(tǒng)[10]、神經(jīng)系統(tǒng)[11]的保護以及明顯的抗腫瘤[12]、抗肝炎[13]作用已受到廣泛關(guān)注。迄今為止，同時揭示人參皂苷Rg1的多種作用機制未見報道。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合模式識別PLS-DA，對人參皂苷Rg1給藥組和空白組大鼠的血清進行分析，研究兩組大鼠的體內(nèi)代謝差異。PLS-DA屬于有監(jiān)督模式的識別方法，并且具有較強的分類能力。結(jié)果顯示，PLS-DA法能有效的將人參皂苷Rg1給藥組和空白組區(qū)分開，根據(jù)VIP>1.5的為生物目標物，并通過生物分子網(wǎng)絡(luò)鑒定了吡哆醛、甲基尿酸、多巴醌、氟尿苷、氨基葡萄糖、卵磷脂6個差異代謝物。KEGG數(shù)據(jù)庫為代謝物從代謝途徑的水平理解細胞或組織的生物學(xué)意義提供了生物信息資源。但由于數(shù)據(jù)庫的信息還不是很完整，結(jié)合相關(guān)文獻只闡述了2條代謝通路及作用機制，但其他內(nèi)源性代謝物的變化也為后續(xù)的研究提供了依據(jù)。

分析嘧啶代謝通路可知，胸苷磷酸化酶(TP)在氟尿苷的參與下轉(zhuǎn)化為胸苷激酶。TP是嘧啶代謝及DNA合成的關(guān)鍵酶 ，通過參與細胞信號傳導(dǎo)來促進癌細胞生長同時抑制正常細胞凋亡[14]。研究表明，在腫瘤組織中，TP的表達明顯高于正常組織，尤其在血漿中，高出20倍[15]。在此通路中，TP的異常表達引起直腸癌。根據(jù)其代謝過程可知，目標代謝物氟尿苷下調(diào)，而其上游物只為TP，說明給予人參皂苷Rg1后TP處于抑制狀態(tài)，使其在血清中轉(zhuǎn)化為氟尿苷的水平下調(diào)，而發(fā)揮選擇性細胞抑制作用，TP含量降低可抑制腫瘤和細胞凋亡，以上結(jié)論反映出人參皂苷Rg1可作為TP的抑制劑，明確了人參皂苷Rg1預(yù)防和治療腫瘤的作用機制。

在卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶缺乏疾病通路中，卵磷脂通過血漿卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)催化形成血漿膽固醇酯。LCAT由肝臟合成后釋放入血，在血漿中由高密度脂蛋白中載脂蛋白A激活。在此酶催化下，血漿游離膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯和溶血卵磷脂。研究表明，肝臟疾病時由于肝細胞損傷使LCAT合成減少，導(dǎo)致血漿游離膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀紲p少。血漿LCAT活力高低在肝臟病變中具有重要臨床意義[16]。在此通路中，LCAT與膽固醇酯缺乏癥有關(guān)，進一步分析通路可知，卵磷脂下調(diào)直接導(dǎo)致LCAT的缺乏，由于藥物對大鼠體內(nèi)代謝有干預(yù)作用，使代謝物卵磷脂上調(diào)，可說明該藥物是LCAT的激動劑，LCAT激活可使血漿膽固醇酯增高，從而抑制肝臟疾病。本研究工作證明，人參皂苷Rg1灌胃對正常大鼠機體代謝產(chǎn)生影響，更在生物分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的層面闡釋了人參皂苷Rg1的作用機制，對于同時探討藥物的多種生物效應(yīng)機制提供了新方法。

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佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項目，編號：XSYD2014-021。

那麗莎(1988～)女，黑龍江牡丹江人，在讀碩士研究生。

孫長海(1974～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:schai1974@sohu.com。

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1008-0104(2015)03-0030-03

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