張少君，羅時旋，趙 稷，侯 巍，高金波，滕 楊

(1.佳木斯市傳染病院,黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

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關(guān)黃柏中總黃酮的提取工藝及抗氧化活性研究①

張少君1，羅時旋2，趙 稷2，侯 巍2，高金波2，滕 楊2

(1.佳木斯市傳染病院,黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

關(guān)黃柏；總黃酮；超聲波萃取；抗氧化

黃柏原名“檗木”，始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，為蕓香科植物黃皮樹(Phellodendron chinense Schneid.)或黃檗(Phellodendron amurense Rupr.)的干燥樹皮。《中華人民共和國藥典》將兩者分開，前者習(xí)稱“川黃柏”，后者習(xí)稱“關(guān)黃柏”[1]。其主要化學(xué)成分有生物堿類、黃酮類、內(nèi)酯類、萜類、甾醇類及揮發(fā)油類等[2]。據(jù)有關(guān)資料報道：關(guān)黃柏中的小檗堿具有降血壓、降血糖、抗?jié)僛3]的作用，關(guān)黃柏水提液具有抗痛風(fēng)、抗菌、抗炎、解熱作用[4]。本文旨在確定超聲提取法提取關(guān)黃柏中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝并考察其體外抗氧化活性，為關(guān)黃柏的合理開發(fā)和利用提供一定的理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

關(guān)黃柏購自佳木斯市民生藥行(批號，20100125)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、蘆丁標準品均購自Sigma公司；三(羥甲基)氨基甲烷(鄰苯三酚)購自天津市凱通化學(xué)試劑；焦性沒食子酸購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV757CRT型紫外可見分光光度計(上海精密儀器有限公司制造)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FZ120微型植物粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.3 關(guān)黃柏中黃酮類化合物的提取

1.3.1 單因素實驗

超聲波提取溫度的考察：稱取相同質(zhì)量 5.0g的關(guān)黃柏粉末各 5份，加入體積分數(shù)為 80%的乙醇，料液比為15:1，分別在不同溫度(30、40、50、60、70℃)下超聲提取 20min，抽濾，將濾液補足損失的相應(yīng)體積，搖勻。

超聲波提取料液比的考察：方法同上，分別在不同料液比(5:1、10:1、15:1、20:1、25:1)下于40℃超聲提取20min，考察料液比對提取率的影響。

提取時間的考察：方法同上，在料液比為20:1的條件下于40℃分別超聲10、20、30、40、50、60min，考察超聲提取時間對提取率的影響。

超聲波提取乙醇體積分數(shù)的考察：方法同上，分別加入不同體積分數(shù)的乙醇溶液(50%、60%、70%、80%、90%)，料液比為 15:1，在30℃ 下超聲提取20min，察乙醇體積分數(shù)對提取率的影響。

1.3.2 正交實驗

采用L9(34)正交表進行試驗考察各因素對關(guān)黃柏中總黃酮提取率的綜合影響，以獲得優(yōu)化的工藝條件。

1.4 關(guān)黃柏中總黃酮的含量測定

1.4.1 蘆丁標準溶液的配制

準確稱取20.0mg蘆丁標準品，用體積分數(shù)95%的乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至50.0mL的容量瓶中，定容混勻。蘆丁標準溶液的濃度為400mg/L。分別將其稀釋到 16、32、48、64、80mg/L，分別精密移取1mL至25mL容量瓶中，再分別依次加乙醇 11.0mL，5%的NaNO2溶液1.0mL，搖勻，靜置6min；10%的Al(NO3)3溶液1.0mL，搖勻，靜置6min；5%的NaOH溶液10mL；最后用95%的乙醇定容至25mL，搖勻，靜置15min。以95%的乙醇為空白對照，在波長500nm處測定吸光度A，可得到蘆丁濃度(x)與吸光度(y)之間的關(guān)系曲線方程。

1.4.2 總黃酮提取率的計算

精密移取1mL提取液至25mL容量瓶中。按照1.4.1項下操作，以蘆丁作參照計算關(guān)黃柏中總黃酮的含量。提取率按下式計算：

1.5 黃柏中總黃酮的體外抗氧化活性實驗

樣品溶液配制：從關(guān)黃柏的最佳工藝試驗中所得的總黃酮提取液中分別取出1、1.5、2、2.5、3mL，用70%的乙醇定容至50mL，作為樣品溶液備用。

關(guān)黃柏中的總黃酮清除OH·活性測定[5，6]：按照 Smirnoff 的方法，取不同濃度樣品溶液2.00mL，依次加入9.00mmol/L FeSO41.00mL，9.00mmol/L 水楊酸-乙醇溶液2.00mL，8.80mmol/L H2O22.00mL，用蒸餾水補至7.00mL，于37℃下反應(yīng)30min。紫外可見分光光度計在 510nm處測定吸光度 AX，平行測定三次。

清除率的計算公式：

2 結(jié)果

2.1 單因素實驗結(jié)果

提取溫度對提取率的影響：不同溫度(30、40、50、60、70℃)條件下，總黃酮提取率分別為1.9301%，1.8609%，2.0808%，2.2396%，2.3007%。結(jié)果表明，物質(zhì)的提取率會隨著溫度的升高而增加，這是因為隨著溫度的增加，可溶性成分的溶解度和擴散系數(shù)增大，有利于浸提；但同時溫度的升高還會導(dǎo)致某些不穩(wěn)定物質(zhì)的分解或轉(zhuǎn)化和乙醇揮發(fā)，又會降低其提取率。所以，選擇50、60、70℃作為超聲波提取關(guān)黃柏中總黃酮正交試驗的溫度因素。

料液比對提取率的影響 不同料液比(5:1、10:1、15:1、20:1、25:1)，總黃酮提取率分別為1.5409%，1.8273%，2.0401%，2.3457%，2.1989%。結(jié)果表明，關(guān)黃柏中總黃酮的提取率隨著料液比的增加先增大然后略有下降，這可能是由于溶劑用量較大，溶劑本身對超聲波有一定的吸收損耗，導(dǎo)致在限定的時間內(nèi)提取率稍有下降。但考慮到成本，選擇 10:1、15:1、20:1作為超聲波提取關(guān)黃柏中總黃酮正交試驗的料液比因素。

提取時間對提取率的影響 總黃酮的提取率會隨著提取時間的增大而增加，考慮到提取效率，選擇30、40、50min作為超聲波輔助提取總黃酮正交試驗的時間因素。

乙醇體積分數(shù)對提取率的影響：不同乙醇提價分數(shù)(50%、60%、70%、80%、90%)，總黃酮提取率分別為1.7875%，1.7142%，1.6287%，1.8405%，1.5025%。結(jié)果表明，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，黃柏中總黃酮提取率先增大后下降。這是因為植物果實中的黃酮類物質(zhì)大部分與糖結(jié)合成苷類，以糖配基的形式存在，少部分則以難溶于水或不溶于水的游離黃酮存在。所以隨著乙醇體積分數(shù)的增大，部分酯溶性黃酮一并提取，但隨著乙醇體積分數(shù)的升高，水溶性黃酮的溶解度降低，導(dǎo)致總黃酮提取率下降，所以選擇體積分數(shù)為50%、60%、70% 的乙醇作為超聲波提取關(guān)黃柏中總黃酮正交試驗的因素。

2.2 正交實驗結(jié)果

經(jīng)過正交試驗可知，料液比對關(guān)黃柏中總黃酮提取率的影響最大，溫度對關(guān)黃柏中總黃酮提取率的影響最??；最佳提取工藝條件為提取溫度50℃，料液比20:1，提取時間為40min，乙醇濃度為70%。

2.3 關(guān)黃柏中總黃酮的含量測定

2.3.1 蘆丁標準曲線與回歸方程

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，繪制蘆丁標準曲線下圖所示，其線性回歸方程為：y=0.0092x+0.0231，R2=0.9997，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁的標準曲線

2.3.2 總黃酮提取率的計算結(jié)果

在最佳工藝條件下，關(guān)黃柏中總黃酮的得率為2.31%。

2.4 體外抗氧化活性試驗結(jié)果

表1 不同濃度總黃酮提取液對OH·自由的清除率

3 結(jié)論

[1]簡永耀,靳龍文.不同產(chǎn)地黃柏藥材的質(zhì)量分析[J].淮海醫(yī)學(xué),2007,25(6):5661

[2]郭書好,周明輝.川黃柏葉中黃酮成分的研究[J].暨南大學(xué)學(xué)報,1998,19(5):65-72

[3]MeskheliMB,AntelavaNA,BakuridzeAD,etal.AntidiabeticactivityofberberinandextractobtainedfromthebarkofPhellodendronlavalei,introducedinsubtropicregionsofGeorgia,instreptozotocininduceddiabeticrats[J].GeorgianMedNews, 2011(191): 53-60

[4]滕楊,譚天,羅時旋,等.關(guān)黃柏的超臨界CO2萃取物成分分析及抗氧化性研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2014，31(27)：824-827

[5]滕楊,侯麗然,侯巍,等. 木犀草素-鉻配合物的合成及其清除DPPH自由基活性的研究.中國藥房,2013,39(24)：3666-3669

[6]葛明明, 繆月英,孫麗娜,等.蒲公英根多糖的抗氧化活性研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014,37(2)：39-41

[7]滕楊,王雪,杜波濤,等.金銀花的不同濃度醇提取物對DPPH清除作用的ESR研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2011,34(6)：43-44

[8]候巍,楚婧,候麗然，等.木犀草素與鋅配合物的合成及其DPPH自由基清除活性的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2012,35(4):16-18

Study on extract technology and antioxidant activity of flavonoid from cortex phellodendri amurensis

ZHANGShao-Jun,LUOShi-Xuan,ZhaoJi，HOUWei,GAOJin-Bo,TENGYang

(Hospital of Infectious Diseases, Jiamusi University 154007, China)

Objective: To get the optimizing extraction technology and determine the vitro antioxidant activity of total flavonoids from cortex phellodendri Amurensis. Methods: The extract was obtained from cortex phellodendri Amurensis by ultrasonic extraction technology. orthogonal test method was used to establish the optimum extraction conditions. The scavenging activity on OH·,O-2·and DPPH free radicals were calculated with IC50 value. Results: The best extraction conditions were temperature 70℃, liquid ratio 20:1, extracting time 40min, ethanol concentration 70%.Under the above conditions, the extract rate of flavonoid was 2.31% and IC50 values of scavenging on the OH·,O-2·and DPPH free radicals were 2.9525mg/L, 1.6827mg/L and 1.3951mg/L. Conclusion: Ultrasonic extraction technology is safe and energy-saving to extract favonoids from cortex phellodendri Amurensis with high performance, and the favonoids has a strong antioxidant activity.

Cortex Phellodendri Amurensis; flavonoids; ultrasonic extraction;antioxidant activity

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目，編號：12523059。

楊少君(19～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。

滕楊(19～)女，黑龍江五常人，碩士，講師。E-mail:tengyang19820405@163.com。

R284.2

A

1008-0104(2015)03-0011-03

2015-01-29)