段 峰，劉德軍 (.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 5400；.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)專業(yè)，黑龍江 佳木斯 5400)

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苦碟子注射液對(duì)兔下頜骨骨折愈合的影響①

目的：探討苦碟子注射液在兔下頜骨骨折愈合恢復(fù)過(guò)程中的影響。方法：健康的新西蘭大白兔30只,兔的年齡11～12w,體重2.2～2.5kg。隨機(jī)分為A、B組,每組15只(雌雄不限),A組為實(shí)驗(yàn)組,B組為對(duì)照組。在兔的左側(cè)下頜骨體部做2.0mm×10.0mm的骨折模型。A組建模術(shù)后第2日開(kāi)始每天1次給予腹腔注射苦碟子注射液(10mL/kg),B組作為對(duì)照組不做任何處理。各組分別在術(shù)后1w、3w、5w的時(shí)間點(diǎn)上截取兔的左側(cè)下頜骨行HE染色,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)免疫組化學(xué)染色觀察,骨密度測(cè)定,X線測(cè)定和血清鈣素的測(cè)定。結(jié)果：術(shù)后3w、5w時(shí)A組的骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達(dá)效果均強(qiáng)于B組(P<0.05);術(shù)后1w、3w、5w各時(shí)間點(diǎn)的骨密度測(cè)定,3w、5w比較明顯,在5w時(shí)各組骨密度達(dá)最大值,A組骨密度值均高于B組(P<0.05);術(shù)后1w、3w、5w經(jīng)X線測(cè)定評(píng)分A組優(yōu)于B組(P<0.05);血清鈣素水平在1w、3w、5w時(shí)A組均較B組增高明顯(P<0.05)。結(jié)論：苦碟子注射液能積極有效的促進(jìn)兔下頜骨骨折的愈合。

苦碟子注射液；兔；骨折愈合；BMP-2

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,交通的發(fā)達(dá),車(chē)禍外傷造成的頜面部骨折已成為口腔頜面外科常見(jiàn)病和多發(fā)病。目前西醫(yī)主要通過(guò)骨折的內(nèi)外固定,電刺激,生物原刺激等來(lái)修復(fù)骨組織的愈合再生。本實(shí)驗(yàn)主要研究探討中藥制劑苦碟子注射液在兔下頜骨骨折術(shù)后恢復(fù)階段產(chǎn)生的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑、器材

新西蘭白兔30只(體質(zhì)健康，雌雄不限),兔的年齡11～12w,重量2.2～2.5kg(大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心),苦碟子注射液(通化華夏藥業(yè)集團(tuán)),Ⅲ型X線機(jī)(日本島津公司),骨密度掃描儀器(佳木斯大學(xué)附屬醫(yī)院),骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)抗體∕SABC免疫組化學(xué)試劑盒∕DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 兔下頜骨骨折模型的制備及實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)所用的30只新西蘭大白兔術(shù)前禁食水10h,禁食水10h后10%水合氯醛給予腹腔注射麻醉,(4mL/kg)，待其麻醉后術(shù)區(qū)消毒,遵循無(wú)菌操作步驟，于左側(cè)下頜骨體部用一次性手術(shù)刀切開(kāi)下頜骨體部術(shù)區(qū),剝離組織，顯露骨質(zhì),在下頜骨體部用牙科高速渦輪鉆制作2.0mm×10.0mm骨缺損斷裂模型。術(shù)區(qū)0.9%氯化鈉鹽水沖洗,檢查無(wú)異常后逐層縫合術(shù)區(qū)創(chuàng)口。術(shù)后隨機(jī)分為A、B組飼養(yǎng)(A為實(shí)驗(yàn)組,B為對(duì)照組),每組15只。術(shù)后當(dāng)日每組兔子連續(xù)5d給予慶大霉素4萬(wàn)單位肌注,每日一次,隨時(shí)觀察術(shù)區(qū)傷口有無(wú)感染化膿跡象。術(shù)后第2日開(kāi)始,A組每日給予苦碟子注射液腹腔注射(10mL/kg),每日一次 共35d。B組作為對(duì)照組不做任何處理。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1)血清鈣素含量的測(cè)定：兩組實(shí)驗(yàn)兔子分別于術(shù)后1w、3w、5w,每組隨機(jī)抽取5只采取耳緣處的靜脈血2mL,4℃條件下靜置4h,于離心機(jī)中離心10min后取出(4000r/min),取上層血清液,測(cè)定其中骨鈣素含量。

2)骨密度與X線測(cè)定：術(shù)后1w、3w、5w,每組隨機(jī)抽取5只,以4%多聚甲醛心內(nèi)灌注后處死,取左側(cè)下頜骨術(shù)區(qū)及兩端骨折標(biāo)本長(zhǎng)約2.5cm,骨密度掃描儀檢測(cè)每組兔子骨折處的骨密度值,X線片攝取(距離8cm,,曝光3s,電壓50kV,電流30mA),對(duì)每組骨折愈合情況進(jìn)行對(duì)比分析。

3)組織學(xué)觀察：術(shù)后1w、3w、5w切取的骨折部位標(biāo)本待骨密度測(cè)定完成后,10%多聚甲醛固定20h后,13%螯合劑脫鈣液脫鈣20d, 80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇梯度脫水2h，將包埋框合成模型槽，放入組織注入石蠟包埋,附加標(biāo)簽，將修正好的蠟塊放在金屬持蠟器上制成厚約6μm的切片,將切片行蘇木素-伊紅染色,在光鏡下觀察骨折處骨痂中膠原的沉淀和軟骨的生成狀況,采集新生的骨小梁圖像,用圖像分析軟件進(jìn)行分析,逐個(gè)算出視野中新形成的骨占原有骨面積百分比。免疫組化檢測(cè) 部分切片行骨形態(tài)發(fā)生蛋白免疫組織化學(xué)染色,測(cè)量其灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清鈣素測(cè)定

術(shù)后1w、3w、5w分別采取兩組兔耳緣靜脈血，1wA,B組的血清鈣素水平呈平穩(wěn)緩慢增高,3wA組增長(zhǎng)幅度較B組更明顯, 術(shù)后5w血清鈣素水平達(dá)最大值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 術(shù)后1w、3w、5wA,B組血清鈣素測(cè)定

組別1W3W5WA3.82±0.274.26±0.314.75±0.42B2.51±0.152.95±0.263.34±0.28

與B組比較P<0.05。

2.2X線顯示結(jié)果

術(shù)后1w,A、B兩組骨折處X線片上骨折痕跡明顯,未見(jiàn)斷端橋接,A組骨折處新形成骨痂面積略大于B組。術(shù)后3w,A組術(shù)區(qū)骨折痕跡變得模糊,骨折處有連續(xù)的大面積骨痂形成,骨折處已橋接,B組骨折處仍可見(jiàn)骨折線,骨痂體積較小,骨折斷端才開(kāi)始橋接。術(shù)后5w,A、B兩組骨折處均已橋接,A組骨折處新形成的骨痂體積較大, 骨折處塑形較好，密度接近于皮質(zhì)骨,部分髓腔出現(xiàn)再通,骨折痕跡基本消失不見(jiàn),恢復(fù)程度達(dá)骨性愈合標(biāo)準(zhǔn),B組在骨折處骨痂形成體積相對(duì)較小,骨折處骨痂密度較低,塑形略差，各方面均明顯不及A組,見(jiàn)圖1。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)A組X線評(píng)分高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

與B組比較P<0.05

A組術(shù)后1W A組術(shù)后3W A組術(shù)后5W

B組術(shù)后1W B組術(shù)后3W B組術(shù)后5W

2.3 骨密度測(cè)定

術(shù)后1w、3w、5w2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨折處的骨痂密度及灰度值均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì),其中注射藥物的A組較對(duì)照組B增長(zhǎng)明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在實(shí)驗(yàn)5w達(dá)最大值,見(jiàn)表3。

表3 術(shù)后不同時(shí)間骨密度及BMP-2免疫組織化學(xué)灰度值

與B組比較P<0.05

2.4HE染色觀察

HE染色后5w,A組骨折斷端處可見(jiàn)大量軟骨細(xì)胞,骨細(xì)胞,軟骨基質(zhì),且有大量編織骨與板層骨,A組可見(jiàn)連續(xù)且粗大的骨小梁,表面見(jiàn)成骨細(xì)胞,B組骨小梁發(fā)育生長(zhǎng)較差,骨小梁細(xì)小且數(shù)量少,連續(xù)性較低。

2.5BMP-2免疫組織化學(xué)觀察

術(shù)后1w、3w,A組骨痂呈肥大型較B組明顯,骨化區(qū)骨形態(tài)發(fā)生蛋白呈陽(yáng)性,5w時(shí)陽(yáng)性較明顯,B組呈弱陽(yáng)性,術(shù)后1w、3w、5w,A組骨形態(tài)發(fā)生蛋白免疫組化灰度值均大于B組,術(shù)后3w、5w差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

3 討論

臨床工作中,由于腫瘤、外傷、炎癥等造成的骨缺損是醫(yī)生常見(jiàn)問(wèn)題。骨缺損的延期愈合或者不愈合常常困擾患者及臨床醫(yī)生,如何更好、更快的使骨折盡早愈合一直是大家探討的熱門(mén)課題。本實(shí)驗(yàn)主要探討中藥制劑對(duì)骨折缺損修復(fù)的影響。骨折愈合是復(fù)雜的修復(fù)過(guò)程, 骨折后骨折端及周?chē)M織將出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、血腫機(jī)化、細(xì)胞增生及鈣化等一系列過(guò)程，最后恢復(fù)骨的連續(xù)性，達(dá)到骨愈合。骨折愈合是一個(gè)很復(fù)雜的問(wèn)題，受多種因素的影響。各個(gè)階段均是有典型的生物學(xué)及組織學(xué)特征,該過(guò)程是各種因素相互協(xié)同、拮抗的結(jié)果。因此,我們探討一種藥物對(duì)骨折愈合的影響,應(yīng)從多方面進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中X線片觀察示苦碟子注射液可使骨折斷端處鈣鹽沉積量增加,增加骨痂形成體積和范圍，加快骨小梁生長(zhǎng)和重建。骨力學(xué)強(qiáng)度體現(xiàn)了骨組織密度的高低,本實(shí)驗(yàn)中苦碟子注射液對(duì)骨密度起到促進(jìn)作用,增加骨折區(qū)骨力學(xué)強(qiáng)度。血清鈣素與骨鈣素含量成正相關(guān),血清中骨鈣素的含量對(duì)了解骨生理、代謝的變化及成骨細(xì)胞功能狀態(tài)是有一定意義的。苦碟子注射液能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞活性,加速礦化進(jìn)程,骨形態(tài)發(fā)生蛋白是骨缺損修復(fù)再生的重要生長(zhǎng)因子,主要起誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞的分化增殖為成骨細(xì)胞,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和膠原合成,形成新骨。因此,通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中骨形態(tài)發(fā)生蛋白含量就可以大致掌握骨痂形成狀況。A組3w、5w時(shí),骨折區(qū)骨形態(tài)發(fā)生蛋白含量明顯高于B組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明苦碟子注射液通過(guò)促進(jìn)骨細(xì)胞形成來(lái)加速骨折愈合進(jìn)度。綜上所述,從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,苦碟子注射液可以明顯的增加骨折區(qū)骨痂面積、成骨細(xì)胞數(shù)量、骨小梁密度和塑性情況,顯著提高骨折處骨密度,礦物質(zhì)含量,促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白表達(dá),有利于骨折愈合。

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段峰(1972～)男，黑龍江佳木斯人，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，副主任醫(yī)師，主要從事口腔頜面外科臨床及研究工作。

劉德軍(1981～)男，黑龍江哈爾濱人，在讀碩士研究生。E-mail：394133047@qq.com。

段 峰1，劉德軍2(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)專業(yè)，黑龍江 佳木斯 154002)

R782.2+

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1008-0104(2015)03-0120-02

2014-11-25)