劉 欣，胡國(guó)林，張 宇，齊志國(guó)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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興奮性氨基酸對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究①

劉 欣，胡國(guó)林，張 宇，齊志國(guó)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過(guò)不同濃度谷氨酸對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的致傷作用及其相關(guān)機(jī)制的研究，目的在于揭示興奮氨基酸對(duì)神經(jīng)發(fā)生的作用，為多種神經(jīng)缺失性病變的修復(fù)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：取孕16d胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)，分為正常對(duì)照組、Glu高濃度組和Glu低濃度組。臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞死亡率，全細(xì)胞膜片鉗記錄。結(jié)果：100μmol/LGlu干預(yù)24h后有30%神經(jīng)干細(xì)胞死亡，300μmol/LGlu干預(yù)24h后有70%的神經(jīng)干細(xì)胞死亡。300μmol/LGlu干預(yù)24h后可誘導(dǎo)(1000.25±104.67)pA內(nèi)向電流與正常對(duì)照組和100μmol/LGlu干預(yù)24h后相比有顯著差異(P<0.01)。結(jié)論：隨著谷氨酸濃度的增加，神經(jīng)干細(xì)胞死亡率增加，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)向電流增大，可能是其死亡率增加的原因之一。

谷氨酸；胱氨酸；神經(jīng)干細(xì)胞。

谷氨酸(glutamicacid，Glu)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，是腦組織中含量最高的一種氨基酸，參與多種生理功能的調(diào)控。正常情況下，Glu大部分存在于神經(jīng)末梢內(nèi)的Glu囊泡中，未梢去極化興奮時(shí)，通過(guò)Ca2+依賴(lài)方式釋放。但過(guò)量的Glu對(duì)神經(jīng)有損傷作用。許多病理情況如癲癇、缺血、神經(jīng)退行性疾病(帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥和阿爾茲海默癥) 等都與谷氨酸興奮毒性介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)[1]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

孕16d胚胎鼠由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，分為正常對(duì)照組、高濃度谷氨酸組和低濃度谷氨酸組各10只。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)：無(wú)菌操作取出海馬組織，置于裝有D-Hank's液的培養(yǎng)皿內(nèi)返復(fù)沖洗，剪切為1mm3左右的組織塊，用巴氏吸管反復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，1000rpm×5min離心，用神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并加入b-FGF吹打，分散制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)400目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除細(xì)胞團(tuán)塊，取濾液，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，以3×104個(gè)/mL接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5d換半液，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)7～9d后進(jìn)行試驗(yàn)[2]。

1.2.2 海馬神經(jīng)干細(xì)胞死亡率檢測(cè):稱(chēng)取臺(tái)盼藍(lán)4g，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100mL，濾紙過(guò)濾，PBS稀釋至0.4%。胰酶消化貼壁的神經(jīng)干細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9:1混合混勻，在3min內(nèi)分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞(未藍(lán)染細(xì)胞)和死細(xì)胞( 藍(lán)染細(xì)胞)。死亡率=藍(lán)染細(xì)胞/( 藍(lán)染細(xì)胞+未藍(lán)染細(xì)胞)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄：打開(kāi)膜片鉗放大器和數(shù)模轉(zhuǎn)換器，將盛有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)皿倒置，通過(guò)顯微鏡和CCD圖像傳感器可視下挑選狀態(tài)較好、突觸完整邊界折光度好的神經(jīng)干細(xì)胞；在3-5MΩ電極電阻下高阻抗封接，形成全細(xì)胞記錄模式，應(yīng)用膜片鉗放大器記錄電流，2kHz濾波，采樣頻率為5kHz，PCLAMP-10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和分析[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩種濃度的Glu對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的影響的光學(xué)顯微鏡下的變化。正常傳三代培養(yǎng)液中的海馬干細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞聚集成球，細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核大且有立體感，折光性強(qiáng)。在100μmol/LGlu干預(yù)24h后有一定數(shù)量細(xì)胞從細(xì)胞球中脫落，沉于培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞無(wú)折光性，色暗，胞體變小，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞無(wú)法辨認(rèn)，有少許此種表現(xiàn)細(xì)胞附于細(xì)胞球外，使細(xì)胞球變形或是折光性差。而在 300μmol/LGlu干預(yù)24h后，此種表現(xiàn)更加明顯。行臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞可見(jiàn)100μmol/LGlu干預(yù)24h后有30%神經(jīng)干細(xì)胞死亡，300μmol/LGlu干預(yù)24h后有70%的神經(jīng)干細(xì)胞死亡(P<0.01)。

2.2 兩種濃度的Glu對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞膜電流的影響。在膜電位為- 70mV下記錄到全細(xì)胞電流，100μmol/LGlu干預(yù)24h后可誘導(dǎo)(300.67±14.55)

pA內(nèi)向電流與正常對(duì)照組(66.01±4.12)pA相比有顯著差異(P<0.01)。300μmol/LGlu干預(yù)24h后可誘導(dǎo)(1000.25±104.67)pA內(nèi)向電流與正常對(duì)照組和100μmol/LGlu干預(yù)24h后相比有顯著差異(P<0.01)。

表1 不同濃度谷氨酸對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞致死率和內(nèi)向電流的測(cè)定

a與正常對(duì)照組相比，P<0.01；b與100μmol/LGlu干預(yù)組相比，P<0.01。

3 討論

興奮性氨基酸作為神經(jīng)遞質(zhì)其興奮性毒性在神經(jīng)細(xì)胞中的作用已經(jīng)受到了極大的關(guān)注。其經(jīng)受體作用持續(xù)活化神經(jīng)細(xì)胞致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生死亡或凋亡[4]。在興奮性氨基酸中谷氨酸作為人體神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高、分布最廣、作用最強(qiáng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在人的胚胎初期，通過(guò)不均衡營(yíng)養(yǎng)作用，造成基底神經(jīng)節(jié)和邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元數(shù)目的不適當(dāng)增加。在一般情況下谷氨酸多數(shù)存在于神經(jīng)突觸的囊泡內(nèi)，當(dāng)神經(jīng)末梢電位發(fā)生去極化時(shí)，囊泡與突觸前膜結(jié)合，將其釋放到突觸間隙，與后膜特異受體結(jié)合，完成興奮性突觸傳遞，發(fā)揮其生理作用。研究表明[5]，當(dāng)過(guò)量產(chǎn)生谷氨酸時(shí)，其在神經(jīng)系統(tǒng)中表現(xiàn)的具有神經(jīng)毒性的作用，即所謂的興奮性毒性作用。當(dāng)過(guò)量的谷氨酸與受體結(jié)合后，引起細(xì)胞Ca2+大量?jī)?nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷，引起Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而激活依賴(lài)于鈣的酶系統(tǒng)引起一系列的細(xì)胞損傷。這是認(rèn)為較為經(jīng)典的致傷途徑。隨著研究的進(jìn)一步深入其神經(jīng)毒性作用是多途徑的，可通過(guò)抑制細(xì)胞膜上谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[6]，該作用以細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽耗竭和活性氧成分升高為主要特征，被稱(chēng)為谷氨酸的氧化毒性，對(duì)許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有重要意義。本研究就針對(duì)不同濃度的谷氨酸對(duì)海馬區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞的致傷作用的研究來(lái)明確其對(duì)神經(jīng)發(fā)生有作用。隨著谷氨酸濃度的增加，其引起神經(jīng)干細(xì)胞死亡的能力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到，300μmol/LGlu干預(yù)24h后細(xì)胞死亡率明顯增加，細(xì)胞形態(tài)變化明顯。Tan等[7]采用海馬細(xì)胞系HT-22細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在BSO的作用下細(xì)胞內(nèi)活性氧成分緩慢上升，而用谷氨酸后細(xì)胞內(nèi)活性氧成分的升高24h后大部分的細(xì)胞死亡的研究結(jié)果相似。為了進(jìn)一步明確其損傷機(jī)制，本研究應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，行全細(xì)胞電壓鉗檢測(cè)，對(duì)不同濃度的Glu干預(yù)24h后全細(xì)胞電流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的谷氨酸更能引起更大的細(xì)胞內(nèi)向電流。其內(nèi)向電流是否為其致傷的主要因素，還需進(jìn)一步研究。但內(nèi)向電流的增大是比較明確的，內(nèi)向電流是由什么離子跨膜運(yùn)動(dòng)形成的，有實(shí)驗(yàn)研究觀察到，在正常膜電位時(shí)，除去細(xì)胞內(nèi)K+或增加細(xì)胞外K+的濃度都能抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取功能[8]。如使膜去極化，膜電位從-80mV降至-18mV，谷氨酸的攝取也顯著下降。細(xì)胞內(nèi)的K+可以用銫離子或銣離子來(lái)代替，而細(xì)胞外Na+的功能卻相對(duì)特異，似乎沒(méi)有其他離子能替代。鈣離子的作用在其中還有待于進(jìn)一研究。

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2014年佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目,編號(hào)：LZR2014_17。

劉欣(1988～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

齊志國(guó)(1972～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：drqizhiguo@163.com。

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文章編號(hào)：1008-0104(2015)03-0050-02

2015-03-09)