張愛(ài)華，周一莎

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

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基質(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14)在膽脂瘤型中耳炎中的表達(dá)及意義①

張愛(ài)華，周一莎

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

目的:研究基質(zhì)金屬蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14， MMP-14)在膽脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的表達(dá)特點(diǎn)及意義，并探討 MMP-14對(duì)膽脂瘤型中耳炎侵襲能力的影響。方法:采用免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測(cè)MMP-14膽脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的表達(dá)。結(jié)果:31例膽脂瘤型中耳炎上皮中MMP-14的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常外耳道上皮中的陽(yáng)性表達(dá)。其中膽脂瘤上皮表達(dá)的染色結(jié)果表現(xiàn)最強(qiáng)，多在中至強(qiáng)陽(yáng)性，其余上皮組織中各層細(xì)胞均有不同表達(dá)，基底膜染色強(qiáng)。結(jié)論:MMP-14可能在膽脂瘤型中耳炎上皮的增值與骨破壞中起重要作用。

膽脂瘤；中耳炎；基質(zhì)金屬蛋白酶類

膽脂瘤型中耳炎(cholesteatoma of middle ear)是耳鼻咽喉科常見(jiàn)的疾病，是一種位于中耳乳突腔內(nèi)的囊性結(jié)構(gòu)，而非真性腫瘤，臨床發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤型中耳炎具有類似于惡性腫瘤的生物學(xué)特征，如破壞性、侵襲性、遷移性、異常調(diào)的增殖性、復(fù)發(fā)性等，但本病在病理上屬于良性病變，而非惡性腫瘤[1]。這些特性能使其導(dǎo)致不同程度的骨質(zhì)破壞，從而引起不同程度的聽(tīng)力損失，甚至引發(fā)前庭功能障礙及面神經(jīng)麻痹一系列病癥，使患者的生命安全受到嚴(yán)重威脅。基質(zhì)金屬蛋白酶( Matrix metalloproteinases MMPs)它是一類能有效降解細(xì)胞外基質(zhì)中鋅離子依賴型的一類蛋白酶，目前在骨質(zhì)吸收與重建中的研究已取得進(jìn)展，其家族中的 MMP-14是 MMPs家族中的一個(gè)Ⅰ型跨膜蛋白酶膜，活化的 MMP-14能夠直接和間接的降解基底膜( BM)和細(xì)胞外基質(zhì)( ECM)成份，能夠降解細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子受體或生長(zhǎng)因子連接蛋白，在腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中起重要的作用。MMP-14在MMPs中有不可代替的作用。本文中采用免疫組織化學(xué)方法來(lái)檢測(cè) MMP-14在膽脂瘤型中耳炎上皮中的分布及表達(dá)水平，根據(jù)結(jié)果進(jìn)一步探討在膽脂瘤上皮增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

31例膽脂瘤型中耳炎上皮組織標(biāo)本均取自黑龍江省佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科2014-02～2014-11，經(jīng)手術(shù)切除的后天繼發(fā)性膽脂瘤型中耳炎的膽脂瘤上皮組織，術(shù)后經(jīng)蘇木精—伊紅染色( HE染色)確診是膽脂瘤上皮，其中，男性標(biāo)本18例，女性標(biāo)本13例，年齡16～61歲，平均42.6歲。另外選11例患者取外耳道正常皮膚組織作為對(duì)照。并將標(biāo)本甲醛固定，再用酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

1.2 試劑

鼠抗人MMP-14多克隆抗體,SP試劑盒等均購(gòu)自上海越研生物科技有限公司。

1.3 方法

所有標(biāo)本都經(jīng)過(guò)HE染色并明確病理診斷，切片厚度取4～5μm。MMP-14應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)。將石蠟切片、脫蠟、水化，后用3%H2O2室溫孵育10～20min，PBS 沖3min×3；經(jīng)胰酶消化后37℃孵育箱25min，用PBS沖洗5min×3；再滴入血清室溫孵育5min，用PBS 沖洗；加1抗MMP-14，經(jīng)4℃過(guò)夜，PBS沖洗5min×3;滴入生物素標(biāo)記的2抗，再經(jīng)室溫孵育、PBS沖洗；滴加過(guò)氧化物親和素酶溶液， 孵育、沖洗；滴加DAB顯色液，鏡下觀測(cè)并控制顯色時(shí)間；經(jīng)自來(lái)水清洗后用蘇木復(fù)染、脫水、透明、封片。用已知陽(yáng)性對(duì)照片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS 代替1抗作為陰性對(duì)照。

1.4 染色判定

本實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞內(nèi)染色表現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽(yáng)性，并以任意五個(gè)400倍鏡下視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例分為：陰性(-)；弱陽(yáng)性(+)；陽(yáng)性()；強(qiáng)陽(yáng)性()。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為：(15%；16%～30%；31%～50%)50%。

圖1 膽脂瘤上皮的HE染色SP×400

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。采用成組設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)來(lái)分析膽脂瘤上皮和正常外耳道上皮之間蛋白表達(dá)水平。

圖2 MMP-14在膽脂瘤上皮中陽(yáng)性表達(dá)SP×400

圖3 正常外耳道皮膚的HE染色SP×400

圖4 MMP-14在外耳道皮膚中陰性表達(dá)SP×400

2 結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)MMP-14膽脂瘤型中耳炎上皮組織和外耳道正常上皮組織的表達(dá)分布中，以細(xì)胞漿和細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果，膽脂瘤型中耳炎上皮表現(xiàn)染色較強(qiáng)，多為陽(yáng)性至強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。外耳道正常上皮組織細(xì)胞有表達(dá)，但染色較弱。MMP-14在膽脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)表1。

表1 MMP-14在膽脂瘤及外耳道皮膚中的陽(yáng)性表達(dá)

注:★P<0.05。

3 討論

膽脂瘤型中耳炎是耳鼻喉科中較常見(jiàn)的炎性疾病，是慢性化膿性中耳炎(單純型、骨瘍型與膽脂瘤型)中的一型，雖然他叫瘤但并非真正意義上的腫瘤，他是上皮組織不斷堆積而且破壞周圍組織，骨質(zhì)而形成的，但他也具有許多類似惡性腫瘤的生物學(xué)特征，比如侵襲性、破壞性、非正常調(diào)控下的增殖性、復(fù)發(fā)性等，膽脂瘤上皮不斷堆積破壞正常中耳腔結(jié)

構(gòu)和顳骨骨質(zhì)。其破壞機(jī)理還未完全明了。有相關(guān)文獻(xiàn)顯示在無(wú)膽脂瘤的化膿性中耳炎(單純型、骨瘍型)中，骨吸收幾乎不明顯。因此推測(cè)膽脂瘤可能是顳骨骨吸收的重要因素[2]。近年來(lái)，MMPs家族在膽脂瘤型中耳炎中的作用明顯受到關(guān)注。MMPs家族可通過(guò)破壞細(xì)胞外基質(zhì)、降解骨膠原等途徑，在病生過(guò)程中起到重要作用。在MMPs家族中目前已至少發(fā)現(xiàn)16種酶，其中MMP-14是MMPs家族中的特殊蛋白酶，除了具有原有的MMPs結(jié)構(gòu)外，還有梭基端穿膜區(qū)(transmem-branedomainTM)，TM可使MMP-14表達(dá)為一種膜蛋白，主要分布在細(xì)胞膜表面，主要功能為降解細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白，并且是明膠酶-A酶原的表面受體激活物，目前研究表示，MMP-14可降解并破壞腫瘤患者的細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜，并且破壞阻止腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)屏障。還使MMP-2酶原激活而進(jìn)一步加強(qiáng)作用[3]。有實(shí)驗(yàn)顯示膽脂瘤侵襲能力與MMP-2表達(dá)灰度有顯著相關(guān)性,表明MMPs在中耳膽脂瘤的骨質(zhì)破壞中發(fā)揮重要作用[4]。研究證實(shí)MMPs直接參與生理及病理性溶骨機(jī)制, 其家族中的MMP-9是膽脂瘤骨質(zhì)破壞中的很重要的一種酶,與膽脂瘤的破壞作用關(guān)系密切[5]。在炎癥癥狀較重的膽脂瘤中，基底膜不連續(xù)，缺少相對(duì)膠原的免疫反應(yīng)物，所以膽脂瘤骨質(zhì)破壞機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的、多因素共同作用過(guò)程，多種影響因素之間存在著相互關(guān)系。在本次實(shí)驗(yàn)中顯示，MMP-14在膽脂瘤上皮組織中表達(dá)了很高的水平，在正常外耳道皮膚表達(dá)低水平，表明其在膽脂瘤型中耳炎的骨質(zhì)破壞中發(fā)揮重要作用。骨質(zhì)的降解和骨基質(zhì)內(nèi)膠原的水解過(guò)程都與活性的MMP-14有關(guān)，使膽脂瘤表現(xiàn)出類似惡性腫瘤的侵襲性和骨破壞性。由此可見(jiàn)，MMP-14在膽脂瘤的侵襲性及骨質(zhì)破壞過(guò)程中起到重要作用。

[1]李冬,龔樹(shù)生,黃芳,等.中耳膽脂瘤研究進(jìn)展及其與凋亡抑制蛋白survivin和Bcl-2的關(guān)系[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,21(1):39-41Z

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[4]周旭峰,姚雅芬.MMP-2和CD147在中耳膽脂瘤中的表達(dá)[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2008，31(3):27-28

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2014年佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：LM2014-032

張愛(ài)華(1962～)女，黑龍江佳木斯人，主任醫(yī)師，教授，研究生導(dǎo)師。研究方向：耳顯微外科研究。

周一莎(1984～)男，黑龍江佳木斯人，在讀研究生。E-mail:zhouyisha728@163.com。

R764.21

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1008-0104(2015)03-0035-02

2014-12-01)