魏春杰，江清林，朱曉峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)三科，黑龍江 佳木斯 154003)

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神經(jīng)生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響①

魏春杰，江清林，朱曉峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)三科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:探討神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor，NGF)與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)體外實驗對神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響。方法:體外應(yīng)用半固體培養(yǎng)法連續(xù)14天觀察不同濃度的NGF、BDNF及NGF+BDNF組合誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的情況。結(jié)果:體外條件下不同濃度的神經(jīng)營養(yǎng)因子的組間和組內(nèi)比較顯示，100μg/LBDNF誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移作用最明顯。BDNF+NGF聯(lián)合組在誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移方面未見協(xié)同效應(yīng)。結(jié)論:NGF、BDNF二者皆有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的作用，100μg/LBDNF組誘導(dǎo)遷移作用最明顯。

神經(jīng)生長因子；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；神經(jīng)干細(xì)胞；遷移

神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點問題，它的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療開拓了新的前景[1，2]。其增殖、定向誘導(dǎo)分化研究方面都取得了一定的成績，但針對神經(jīng)干細(xì)胞遷移方面的研究較少。本實驗在體外條件下探討不同濃度的NGF、BDNF及其組合誘導(dǎo)NSCs遷移中的作用，并對兩種因子及組合進(jìn)行擇優(yōu)，選出最佳濃度的因子，為下一步體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar新生鼠，由本校動物實驗中心提供。 主要試劑：DMEM/F12、B27、熒光FITC標(biāo)記試劑，DAB顯色試劑，BrdU、NSE、nestin、GFAP一抗，SABC-FITC、SABC-CY3，EGF、bFGF、BDNF因子，羊抗小鼠Cy3，低熔點瓊脂糖。

1.2 方法

神經(jīng)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：選用Wistar新生鼠，取海馬組織，經(jīng)D-Hanks，液漂洗后將腦組織置入小瓶中剪碎，加入無血清培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，臺盼蘭染色計數(shù)，于每個培養(yǎng)瓶中加入密度約為5×105/mL細(xì)胞懸液4mL左右。置于37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。待原代克隆形成后再次分離制作單細(xì)胞懸液，此后每隔3d半量換液，5～7d分離神經(jīng)球進(jìn)行傳代[3]。

半固體培養(yǎng)：①取蓋玻片置于3.5cm培養(yǎng)皿底部，基本培養(yǎng)液為含0.3%低熔點瓊脂和2%B27的DMEM/F12(撤走bFGF)。在蓋玻片上用5%的瓊脂和神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophicfactor，NTF)制成NTF擴(kuò)散源，將傳代三代后得神經(jīng)干細(xì)胞分散放置于NTF擴(kuò)散源周圍的蓋玻片上，培養(yǎng)于基本培養(yǎng)液中，觀察不同因子不同濃度制成的擴(kuò)散源誘導(dǎo)NSCs遷移情況，并跟蹤觀察各組實驗細(xì)胞遷移行為及形態(tài)學(xué)變化[4]。

②分組：BDNF：濃度1μg/L、10μg/L、100μg/L，共3組。NGF： 濃度1μg/L、10μg/L、100μg/L，共3組。BDNF+NGF：從上述六組中篩選出兩種因子的最佳濃度組成1組?？瞻讓φ战M：不加任何NTF。

免疫細(xì)胞組織化學(xué)及熒光實驗：nestin標(biāo)記：將傳代三次后的細(xì)胞團(tuán)貼壁培養(yǎng)48h后進(jìn)行nestin免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。數(shù)碼照相機(jī)拍照，各組均設(shè)陰性對照，陰性對照切片以PBS替代一抗，其余步驟相同。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

連續(xù)14d觀察接種在培養(yǎng)皿上的神經(jīng)干細(xì)胞，見細(xì)胞生長狀態(tài)良好，倒置顯微鏡下細(xì)胞折光性強(qiáng) (見圖2) 。神經(jīng)干細(xì)胞球貼壁培養(yǎng)后24h，作Nestin免疫熒光鑒定絕大部分細(xì)胞顯示nestin陽性細(xì)胞團(tuán)呈綠色，遷出分化的NSCs呈陰性(見圖1)。BrdU標(biāo)記移植前之神經(jīng)干細(xì)胞，免疫組化見大量神經(jīng)細(xì)胞呈胞核被染色而胞漿未被染色Brdu標(biāo)記陽性細(xì)胞，少部分未被標(biāo)記。(見圖3)。鏡下見BDNF各組神經(jīng)元樣細(xì)胞多，胞體面積大，突起長，14d時胞體多呈現(xiàn)三角行或多邊形，分支豐富。NGF各組細(xì)胞呈現(xiàn)類圓形或類星形，胞體較大，細(xì)胞伸出較多突起并逐漸延長，突起末端分支可見膨大的生長錐。鏡下觀察見BDNF組及NGF組細(xì)胞遷出均有方向性趨勢，但不同濃度的因子誘導(dǎo)NSCs遷移現(xiàn)象是有差別的。高濃度組中細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞向培養(yǎng)皿中心即因子擴(kuò)散源方向遷出趨勢明顯，向這一個方向伸出的突觸也較長較粗。這種效果距離因子越近就越明顯，部分干細(xì)胞球團(tuán)伸出類柱狀的突起，遷向因子方向。各濃度組細(xì)胞突起均隨時間推移逐漸增長，100?g/LBDNF組誘導(dǎo)遷移距離最長可達(dá)1200μm以上(見圖4)。而對照組干細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞是向四周均勻分散遷出的，與實驗組相比較遷移距離較近(見圖5)。

圖1 圖2 圖3

圖1 神經(jīng)干細(xì)胞球團(tuán)的nestin免疫熒光染色，遷出分化的NSCs呈陰性。(×100)

圖2 原代培養(yǎng)3d時懸浮生長的神經(jīng)干細(xì)胞漸聚集成不規(guī)則的球形細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞結(jié)合疏松(×200)

圖3 神經(jīng)干細(xì)胞的BrdU免疫組化染色，胞核著色，DAB顯色。(×100)

圖4 圖5

圖4 鏡下觀察見100μg/LBDNF組神經(jīng)干細(xì)胞具有向BDNF因子中心方向遷移的趨向性(×200)

圖5 對照組中半固體培養(yǎng)24h，基礎(chǔ)培養(yǎng)液的中神經(jīng)干細(xì)胞有向四周分散遷出趨勢，無明顯方向性。 (×200)

每組取距離因子擴(kuò)散源1.5mm內(nèi)的10個干細(xì)胞球團(tuán)遷移距離的平均值：(×100)

表1 14d時不同組別遷移距離平均值

*：與對照組比較，P<0.05。

組內(nèi)比較：①1μg/LNGF與10μg/LNGF兩濃度組誘導(dǎo)遷移作用比較，差異無顯著性(P>0.05)，但二者與100μg/LNGF誘導(dǎo)遷移作用比較(P<0.01)。②BDNF各濃度組差異皆有顯著性(P<0.01)，提示BDNF對神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)遷移作用具有濃度依賴性。 組間比較：除1μg/LBDNF外，其余所有實驗組與對照組比較(P<0.05)，說明神經(jīng)生長因子與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子具有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的作用。100μg/LBDNF與(100μg/LNGF+100μg/LBDNF)兩組作用皆優(yōu)于100μg/LNGF(P<0.05)，而100μg/LBDNF組與(100μg/LNGF+100μg/LBDNF)組合之間比較(P<0.05)差異無顯著性。本實驗未觀察到兩種因子在誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移方面有協(xié)同效應(yīng)。

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞的遷移機(jī)制非常復(fù)雜，目前主要有放射狀遷移和正切遷移兩種模式[5]。NGF通過物理和化學(xué)兩個方面對神經(jīng)前體細(xì)胞遷移起誘導(dǎo)作用。①物理因素方面：即神經(jīng)前體細(xì)胞沿著放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的長突起方向遷移。NGF僅出現(xiàn)在遷移期的神經(jīng)前體細(xì)胞中，其受體erb表達(dá)于遷移期的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，阻斷受體erb后，神經(jīng)前體細(xì)胞遷移受到抑制。外源性的NGF還可穩(wěn)定原來的突觸接觸和防止突觸可塑性變化[6]。②在化學(xué)因素方面：即神經(jīng)前體經(jīng)細(xì)胞沿著化學(xué)趨化物的方向發(fā)生遷移。神經(jīng)生長因子的彌散濃度梯度為神前體細(xì)胞的遷移提供了化學(xué)信號，研究表明，表達(dá)高親和力受體TrkA的鼠脊索成神經(jīng)元細(xì)胞， 在低濃度的NGF誘導(dǎo)下即能沿著化學(xué)梯度直接發(fā)生遷移[7]。 有研究表明，BDNF能觸發(fā)干細(xì)胞的趨化和運(yùn)動[8]。BDNF的主要作用位點是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸上，其不僅能促進(jìn)突起的再生，而且能提高神經(jīng)元表面BDNF受體TrkB的表達(dá)水平，其對突觸的延伸作用強(qiáng)于NGF[9]。這正與本實驗體外條件下100μg/LBDNF誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移作用優(yōu)于100μg/LNGF的結(jié)論相符。BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)可塑性及祖細(xì)胞遷移中起至關(guān)重要的作用。在神經(jīng)元遷移時期，腦皮質(zhì)內(nèi)存在BDNF高親和力受體TrkB及BDNFmRNA，研究表明，TrkB高親和力受體主要存在于有遷移細(xì)胞的區(qū)域，許多TrkB陽性細(xì)胞均表現(xiàn)出典型遷移神經(jīng)元的特性[10]。我們認(rèn)為，BDNF的濃度與其受體TrkB的表達(dá)有直接的關(guān)系，是BDNF在誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移方面存在濃度依賴性的原因。

本實驗表明神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞遷移誘導(dǎo)作用優(yōu)于NGF，且神經(jīng)干細(xì)胞遷移對其存在濃度依賴性。結(jié)論提示BDNF可在NSCs準(zhǔn)確到達(dá)病灶部位，修復(fù)損傷組織方面起到積極的作用，為如何應(yīng)用NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的思路。

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黑龍江省教育廳資助項目，編號：12521543。

魏春杰(1980～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。

朱曉峰(1963～)男，山東蓬萊人，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師。E-mail:sjkx2727@163.com。

R329.2+

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1008-0104(2015)03-0026-02

2015-02-18)