韓宇鵬，姜 威，楊 松，李 璇，苗秋實，張曉波，鮑秀琦

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院， 黑龍江 佳木斯 154007)

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骨髓單核細胞移植對潰瘍性結腸炎修復過程的影響①

韓宇鵬1，姜 威1，楊 松1，李 璇1，苗秋實1，張曉波2，鮑秀琦1

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院， 黑龍江 佳木斯 154007)

目的：觀察移植骨髓單個核細胞(BM-MNCs)對潰瘍性結腸炎(UC)大鼠結腸病變修復的作用。方法：取SD大鼠45只，其中15只用于提取BM-MNCs，移植組及PBS組各15只，均制作UC模型，移植組及PBS組經尾靜脈分別注射BM-MNCs細胞懸液及PBS液1mL。正常飼養(yǎng)，觀察大鼠的精神、進食、活動及大便情況。并于注射后3d、7d、14d每組各處死大鼠5只，光鏡下觀察結腸組織病變改變。結果：移植后第14天，移植組結腸黏膜病變修復程度明顯優(yōu)于PBS組。結論：BM-MNCs移植可以促進UC大鼠損傷結腸組織的修復。

骨髓單個核細胞；移植；潰瘍性結腸炎。

潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis，UC)屬炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)，主要癥狀有腹瀉、膿血便、腹痛和里急后重。UC的病因可能涉及遺傳、環(huán)境、免疫調節(jié)間復雜的相互作用等多個方面。UC病程漫長，常反復發(fā)作，治愈難度大，被世界衛(wèi)生組織列為現代難治病之一。近年來，潰瘍性結腸炎的發(fā)病率呈逐漸增長趨勢且嚴重威脅病人的健康，傳統(tǒng)治療難以控制此病，而且存在一定的副作用和并發(fā)癥，其治療問題是目前的醫(yī)學難題[1,2]。因此，迫切需要探索新的、有效的治療手段。近年來隨著干細胞研究的不斷深入，人們已開始應用干細胞來治療多種疾病，干細胞移植也逐漸試用于UC患者的治療，為其治療帶來新的契機。

1 材料和方法

1.1 材料

健康成年SD大鼠；弗氏完全佐劑；三硝基苯磺酸(TNBS)；蛋白裂解液(SDS)；透析袋；大鼠淋巴細胞分離液；臺盼藍；水合氯醛等。

1.2 方法

健康清潔級6～8周齡SD大鼠30只，隨機分為移植組及PBS組，每組15只。移植組、PBS組大鼠用免疫復合法制備UC模型。

1.2.1 家兔結腸黏膜抗原制備

取家兔結腸，分離出黏膜層，剪碎后研磨成組織勻漿，加入SDS裂解液，95℃水浴5min，除去組織勻漿中的蛋白酶，15000r/min離心10min，取上清液。將裝有上清液兩端扎緊的透析袋放入生理鹽水中，逐漸減少生理鹽水濃度，濾出上清液中的SDS。雙縮脲法檢測其蛋白含量(20mg/mL)，加入等量弗氏完全佐劑制成抗原乳化液。

1.2.2 BM-MNCs的提取

SD大鼠用10%水合氯醛麻醉處死，去除大鼠腿部毛發(fā)，放入75%酒精中浸泡消毒3～5min。在無菌操作條件下去除肌肉、筋膜，暴露股骨及脛骨，離斷關節(jié)，將其取出，分離股骨、脛骨兩端骨皮質，用剪刀在兩端骨骺處分別開一個小孔，用注射器針頭從小孔處插入骨髓腔中，注入5mL抗凝液，反復沖洗骨髓腔，將骨髓沖入空試管中。將骨髓液以4℃，1500r/min離心10min，去除上清液，加入2mL PBS液混合，混合后可再次離心(重復上次)。將骨髓液緩慢加入等量的大鼠淋巴細胞分離液的頂部(注意不要使其與淋巴細胞分離液混合)，以4℃，2000r/分離心15min。去除上清液至中見白色細胞層，用移液器將中間白色層細胞抽出，4℃保存。臺盼藍測BM-MNCs活細胞率。取2滴BM-MNCs懸液移入小試管中，加入1滴0.4%臺盼藍溶液，混勻，用細胞計數板計數，明確成活率[3]。

1.2.3 UC模型制備及BM-MNCs移植

模型制備第1天和第14天分別將0.4mL抗原乳化劑注射于大鼠腹股溝、足跖處，第2次注射后禁食(不禁水)24h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將直徑2mm長15 cm的硅膠管從其肛門輕緩插入約8cm，緩慢推入灌注液0.65 mL(100 mgTNBS/kg+50%乙醇)。灌腸后大鼠保持平躺、臀部抬高至自然清醒。24小時后，移植組大鼠經尾靜脈注入1mLBM-MNCs細胞懸液(細胞含量為3×106個/mL)；PBS組大鼠注入1mLPBS。

1.2.4 組織標本處理

移植后，正常飼養(yǎng)，觀察大鼠的精神、進食、活動及大便情況。細胞移植后3d、7d、14d，兩組各取大鼠5只，麻醉后處死，剖取結腸，縱行剪開，PBS沖洗后觀察結腸大體形態(tài)、黏膜損傷情況。結腸連續(xù)切成2cm為一段的腸段，4%多聚甲醛固定24h；常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(5μm)，HE染色，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。

2 結果

2.1 移植組及PBS組造模1d后，開始出現懶動、拱背、厭食，肛門處可見暗紅色，伴黑色黏稠稀便。3d后移植組及PBS組大鼠癥狀達到高峰，大鼠消瘦，精神萎靡不振，毛發(fā)無光澤，大便明顯減少，為稀便，黏稠，腥臭味，褐色伴有膿汁。7d后移植組大鼠精神狀態(tài)略有好轉，食量有所增加，但仍有少量稀便；PBS組大鼠癥狀無明顯變化，大鼠腹圍有所增大，在移植后的第6天，1只SD大鼠死亡。14d后移植組大鼠一般狀態(tài)尚可，食量增加明顯，仍排稀便，無膿血便，體重略有增加；PBS組大鼠食量略有增加，但癥狀仍無明顯改善，腹圍增大明顯，體重明顯減輕，分別在移植后的9d，13d，2只SD大鼠死亡。

2.2 3d后移植組及PBS組大鼠結腸大體標本可見回盲部結腸擴張，肛門以上13cm處至肛門見結腸黏膜廣泛充血、水腫、糜爛及壞死，并可見潰瘍，直徑約5～10mm。光鏡下：移植組及PBS組可見黏膜層凝固性壞死，黏膜下層及淺肌層可見組織壞死和出血，部分黏膜下層可見血管擴張、充血，部分固有肌層尚存，血管內皮細胞腫脹，漿膜層可見大量纖維素物質滲出。7d后移植組及PBS組大鼠結腸大體標本可見回盲部結腸擴張明顯，距肛門7～11cm處結腸與周圍組織形成粘連、包裹；結腸黏膜仍廣泛充血、水腫、糜爛及壞死。光鏡下可見移植組黏膜層壞死，黏膜下炎性細胞浸潤明顯，血管擴張、充血，肉芽組織增生，肌細胞增生，漿膜層表面少量纖維素物質滲出，纖維組織增生；PBS組光鏡下與移植組相比較可見肉芽組織增生不明顯。14d后移植組大鼠結腸大體標本可見回盲部結腸略有擴張，結腸與周圍組織無黏連，結腸黏膜可見充血、水腫，表面糜爛，未見明確潰瘍，局部黏膜可見瘢痕增生；PBS組大鼠回盲部結腸擴張明顯，距肛門7～13cm處結腸與周圍組織形成黏連、包裹，結腸黏膜仍廣泛充血，水腫，糜爛及壞死。光鏡下：移植組可見新生黏膜上皮及腺體，但仍可見糜爛，黏膜下可見新鮮至成熟肉芽組織，炎性細胞浸潤減少(圖1)；PBS組黏膜層及黏膜下層仍可見壞死，炎性滲出，下層見肉芽組織(圖2)。

圖1 14d移植組大鼠結腸HE

圖2 14d PBS組大鼠結腸HE

3 討論

骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)屬于成體干細胞，它包括造血干細胞、骨髓間充質干細胞和內皮祖細胞等多種潛能干細胞，既具有自我更新和分化潛能，又能釋放某些細胞因子促進神經、血管再生。國內學者谷涌泉等[4]經骨髓動員刺激后行骨髓單個核細胞移植治療病人的下肢的缺血療效顯著，這可能是骨髓單個核細胞群中含有更多的有利于血管新生的細胞亞群。經動員刺激的骨髓內存在大量更原始的干細胞和血管內皮祖細胞, 這些細胞的分化能力更強，更利于細胞的融合和血管的新生。而其中的骨髓間充質干細胞則在骨髓細胞中含量最為豐富，在特定的條件下又可以分化為各胚層細胞，具有強大的擴增能力和多向分化潛能，是較理想的細胞來源。本實驗應用免疫復合法建立UC模型，提取并移植BM-MNCs。3d后移植組及PBS組大鼠結腸組織大體及光鏡下比較無明顯差別；7天后移植組及PBS組大鼠結腸組織大體比較無明顯差別，光鏡下可見移植組黏膜下有肉芽組織增生，而對照組不明顯。14d后對移植組及PBS組大鼠結腸組織進行大體及光鏡下觀察和比較，發(fā)現移植組腸上皮細胞再生，潰瘍面愈合，無出血及滲出病變，炎細胞明顯減少，可見成熟肉芽組織；PBS組仍可見潰瘍存在，滲出及壞死明顯，肉芽組織形成較少，炎細胞明顯浸潤，上皮組織未見增生。表明BM-MNCs移植對大鼠UC有明顯的修復作用。作用機制可能通過BM-MNCs向病變部位定植、BM-MNCs的分化、BM-MNCs對免疫功能的調節(jié)及BM-MNCs對損傷腸道微環(huán)境的建立有關[5]。上述BM-MNCs移植對大鼠UC的修復機制，尚需深入研究。

[1]劉卓勛，顏玉，薛宇，等.貝飛達聯合美沙拉嗪對潰瘍性結腸炎大鼠IL-10表達的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2012，35(1)：380-339

[2]姜威，仁秀英，顏玉.潰瘍性結腸炎的藥物灌腸的臨床療效觀察[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2005，28(3)：112-113

[3]趙中男，楊建華，王瑩，等.熱吉普 骨髓單個核細胞移植對脊髓半橫斷大鼠損傷組織中髓鞘堿性蛋白表達的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2014，37(1)：43-45

[4]谷涌泉，張建，齊立行,等 骨髓動員刺激后自體骨髓源單個核細胞移植治療下肢缺血的初步臨床研究[J].中國修復重建外科雜志，2006，20(10)：1017-1020

[5]李海峰，趙振林.骨髓間充質干細胞治療潰瘍性結腸炎的研究進展[J].臨床醫(yī)藥實踐，2013，22(6):449-453

黑龍江省自然科學基金項目，編號：H201367；黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目，編號：2013245。

韓宇鵬(1982～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

鮑秀琦(1963～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導師。E-mail：Bxq8455@126.com。

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