杜紅蕾,宋春雨,魏春杰,王澤宇,韓 鳳,楊曉玉,盛寶英

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154003)

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神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)AD大鼠行為及突觸素Ⅰ表達(dá)的影響①

杜紅蕾,宋春雨,魏春杰,王澤宇,韓 鳳,楊曉玉,盛寶英

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探究神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植對(duì)β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42) 誘導(dǎo)的阿爾茨海默病(AD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織內(nèi)突觸素I表達(dá)的影響。方法：采用β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)注射到大鼠海馬組織內(nèi)建立阿爾茨海默病(AD)大鼠動(dòng)物模型，通過(guò)Y 迷宮測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和Western blot 技術(shù)檢測(cè)大鼠海馬組織內(nèi)Synapsin I表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，AD模型組、細(xì)胞移植組大鼠學(xué)習(xí)記憶和大鼠海馬組織內(nèi)Synapsin I蛋白表達(dá)量均低(P<0.05),與AD模型組比較，細(xì)胞移植組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和大鼠海馬組織內(nèi)SynapsinI蛋白表達(dá)量均較高(P<0.05)。結(jié)論：NSCs能顯著改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與上調(diào)突觸素Ⅰ的表達(dá)有關(guān)。

神經(jīng)干細(xì)胞；移植；阿爾茨海默??；突觸素I

阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)俗稱老年癡呆癥，是一種以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，目前臨床藥物治療該疾病的效果不甚理想。現(xiàn)有關(guān)神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells，NSCs)治療老年癡呆癥在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了可觀的療效[1]。突觸素I(SynapsinI)是突觸素家族最早發(fā)現(xiàn)位于突觸囊泡膜上的一種特異性磷酸化神經(jīng)蛋白質(zhì)，它在突觸可塑性和神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，它的表達(dá)與突觸的再生、延伸與其功能的恢復(fù)有關(guān)[2]。突觸連接是神經(jīng)元細(xì)胞間信息傳遞的重要結(jié)構(gòu)，也是生物學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生物基礎(chǔ)；SynapsinI分布可間接的反應(yīng)突觸連接的數(shù)量及密度，突觸素I的變化情況能準(zhǔn)確的映射出神經(jīng)元突觸的改變，是突觸重塑的理想標(biāo)志[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)NSCs移植到AD模型大鼠海馬組織中，觀察對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力及海馬組織中SynapsinI蛋白表達(dá)的影響，為探討AD疾病具體發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

10周齡成年Wistar大鼠30只和孕期為14dWistar大鼠1只，體重(230±10)g，SPF級(jí)；所有大鼠均由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合我國(guó)相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定。30只大鼠隨機(jī)分為:細(xì)胞移植組、對(duì)照組、AD模型組， 每組各10只。

1.2 試劑及儀器

主要試劑：DMEM/F12(北京康為世紀(jì))、胰蛋白酶(北京中杉)；多克隆兔抗突觸素I抗體(SantaCruz)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體(SantaCruz)、β-actin鼠單克隆抗體(北京康為世紀(jì))、HRP標(biāo)記抗山羊IgG(武漢博士德)；Aβ1-42(美國(guó)Sigma公司)主要儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱(ThermoForma公司)，Y型電迷宮(張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠)，大鼠立體定向儀SN2型(日本東京成茂科學(xué)器械研究所)，垂直電泳槽(北京六一儀器廠)，轉(zhuǎn)膜儀(德國(guó)GE公司)。

1.3AD動(dòng)物模型制備、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及移植 1.3.1AD動(dòng)物模型制備

采用β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)誘導(dǎo)方法制備AD模型[4]：在無(wú)菌操作下把Aβ1-42溶于生理鹽水中，置于37℃孵育7d以上，使其形成聚集狀態(tài)的Aβ備用；大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，將其固定在立體定位儀上，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，參照包新民等[5]的《大鼠腦立體定位圖譜》，選擇雙側(cè)海馬區(qū)作為注射靶區(qū)，位置距前囟向后3.0mm、中線側(cè)開(kāi)2.2mm處，用微型鉆頭鉆開(kāi)顱骨，垂直于大腦表面用微量進(jìn)樣器進(jìn)針2.8mm，然后將5μL呈聚集狀態(tài)的Aβ以每分鐘1μL速度緩慢注入，留針時(shí)間不少于10min。逐層縫合切口，術(shù)后每天腹腔注射抗生素，飼養(yǎng)7d后行Y迷宮測(cè)試，學(xué)習(xí)和記憶認(rèn)知能力降低則表明制模成功。

1.3.2 神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)

NSCs培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[6]：取孕2周的Wistar大鼠腹腔麻醉后斷頸處死，在無(wú)菌操作下行剖宮取出胚胎，分離得到全腦組織后用HBSS液反復(fù)沖洗；用無(wú)菌剪刀將全腦剪成小塊組織，加入0.25%胰酶消化后，用巴氏吸管反復(fù)多次吹打，使其成為單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入含有bFGF和EG培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放

置在溫度為37℃恒溫條件下5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天取樣鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)，形成原代克隆球后，在次機(jī)械分離使其形成單細(xì)胞懸液， 按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行傳代培養(yǎng)(1:2或1:3比例)，5～7d傳代一次，方法同上。

1.3.3 神經(jīng)干細(xì)胞移植

取傳代培養(yǎng)至4代的神經(jīng)干細(xì)胞球配置成細(xì)胞濃度為1x104/μL細(xì)胞懸液；對(duì)照組大鼠只麻醉不做處理；細(xì)胞移植組大鼠按照制備AD模型的方法進(jìn)入海馬區(qū)，注入上述細(xì)胞懸液5μL注射；AD模型組則注射5μL的生理鹽水做對(duì)照。術(shù)后麻醉清醒后分籠飼養(yǎng)28d后行Y迷宮測(cè)試行為學(xué)觀察。

1.4Westernblot法檢測(cè)大鼠海馬組織內(nèi)突觸素Ⅰ的表達(dá)

大鼠飼養(yǎng)28d后斷頸處死取海馬組織，經(jīng)裂解、離心、8%SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)后分別加入一抗(稀釋1:1000)，4℃濕盒孵育過(guò)夜，TTBS洗膜4次時(shí)間為5min，再加入二抗(稀釋1:3000)，20℃孵育2h，再次TTBS洗膜4次時(shí)間為10min，最后將膜放在含SuperSignalWestPico底物工作液中孵育5min，吸干殘留試劑。曝光顯色拍照后利用Visionworks6.3.3圖像檢測(cè)各條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值作比值，得出各樣品相對(duì)蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)檢測(cè)

Y迷宮測(cè)試：實(shí)驗(yàn)前所有大鼠測(cè)試結(jié)果均為正常未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)；術(shù)后飼養(yǎng)28d大鼠行Y迷宮測(cè)試結(jié)果：與對(duì)照組比較，AD模型組和細(xì)胞移植組大鼠學(xué)習(xí)和記憶均低，且統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P<0.05)；與AD模型組比較，細(xì)胞移植組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Y迷宮測(cè)試結(jié)果

注:與對(duì)照組比較，aP<0.05;與AD模型組比較bP<0.05。

2.2Westernblot檢測(cè)海馬組織內(nèi)SynapsinI表達(dá)

Western結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠海馬組織中SynapsinI蛋白條帶寬而顏色深；與對(duì)照組比較，模型組和細(xì)胞移植組SynapsinI蛋白條帶均明顯變細(xì)顏色變淺；細(xì)胞移植組與AD模型組比較，細(xì)胞移植組SynapsinI蛋白條帶較AD模型組條帶寬且顏色深，即細(xì)胞移植組海馬內(nèi)SynapsinI蛋白的表達(dá)明顯高于AD模型組，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠海馬組織中SynapsinI的表達(dá)

備注：1泳道為對(duì)照組、2泳道為細(xì)胞移植組、3泳道為AD模型組

SynapsinI/GAPDH相對(duì)灰度值結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，細(xì)胞移植組和AD模型組SynapsinI光密度值明顯降低，則SynapsinI蛋白表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這表明AD大鼠下調(diào)了海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞膜上SynapsinI的表達(dá)；與AD模型組比較，細(xì)胞移植組SynapsinI光密度值明顯增加，則SynapsinI蛋白表達(dá)量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這表明移植NSCs的上調(diào)了AD大鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞膜上SynapsinI的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2SynapsinI在海馬組織中的表達(dá)變化(注*表示P<0.05)

3 討論

突觸是兩個(gè)神經(jīng)細(xì)胞傳遞神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)的重要結(jié)構(gòu)。有研究表明，在阿爾茨海默病早期，突觸可出現(xiàn)快速的退行性改變，其退變可遍布包括海馬組織在內(nèi)幾乎所有的新皮質(zhì)[7]。突觸素I(SynapsinI)是突觸素家族最早發(fā)現(xiàn)的位于突觸囊泡膜上的一種特異性磷酸化神經(jīng)蛋白質(zhì)，它在突觸可塑性和神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，它的表達(dá)與突觸的再生、延伸與其功能的恢復(fù)有關(guān)[2]。突觸連接是神經(jīng)元細(xì)胞間信息傳遞的重要結(jié)構(gòu)，也是生物學(xué)習(xí)及記憶的神經(jīng)生物基礎(chǔ)；SynapsinI分布可間接的反應(yīng)突觸連接的數(shù)量及密度，SynapsinI的變化情況能準(zhǔn)確的映射出神經(jīng)元突觸的改變，是突觸重塑的理想標(biāo)志[3]。本實(shí)驗(yàn)選用2周齡大鼠胚胎全腦組織分離培養(yǎng)NSCs，經(jīng)原代及傳代培養(yǎng)后, 經(jīng)證實(shí)將具有自我增殖能力的第4代NSCs采用立體定位法移植到AD模型大鼠海馬組織內(nèi)，飼養(yǎng)28d后通過(guò)Y迷宮檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，結(jié)果顯示實(shí)

驗(yàn)前各組大鼠學(xué)習(xí)記憶未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)；飼養(yǎng)28d后AD模型組和細(xì)胞移植組大鼠學(xué)習(xí)記憶均低于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與AD模型組比較，細(xì)胞移植組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力高于AD模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這驗(yàn)證了李京鳳等[8]人的研究結(jié)果。Westernblot結(jié)果顯示，飼養(yǎng)28d后AD模型組和細(xì)胞移植組大鼠海馬組織SynapsinI蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組，與AD模型組比較，細(xì)胞移植組大鼠海馬組織SynapsinI蛋白表達(dá)量高于AD模型組，張冰清等[9]人研究發(fā)現(xiàn)血管性癡呆大鼠海馬組織中SynapsinI較正常大鼠表達(dá)含量低、分布少，這也間接提示突觸結(jié)構(gòu)數(shù)量減少；這與本文研究的結(jié)果基本一致。因此，移植的NSCs可以改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，這提示移植的NSCs可以促進(jìn)海馬組織中神經(jīng)元的恢復(fù)；這可能是移植的NSCs影響了海馬中神經(jīng)元合成SynapsinI的能力，促進(jìn)了軸漿運(yùn)輸或抑制了神經(jīng)元的衰老或促進(jìn)新蛋白質(zhì)的合成，最終增加了SynapsinI在突觸終末的含量。SynapsinI含量的上升活躍了突觸結(jié)構(gòu)中信息的傳遞，繼而增強(qiáng)了海馬學(xué)習(xí)記憶能力。

本實(shí)驗(yàn)采用NSCs立體定位法移植AD模型大鼠后，上調(diào)例海馬組織內(nèi)SynapsinI蛋白表達(dá)，這可能是由于移植的NSCs改善了海馬組織局部的微環(huán)境，增加突觸的形成及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，增強(qiáng)了神經(jīng)元細(xì)胞信息傳遞功能，繼而改善了AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。所以AD大鼠海馬組織微環(huán)境中SynapsinI蛋白表達(dá)上調(diào)可能是NSCs改善AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的機(jī)制之一；為將來(lái)NSCs運(yùn)用于臨床治療阿爾茨海默病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The Effects of neural stem cells on ethology and expression of synapsin I in aged rats

DUHong-lei,SONGChun-yu,WEIChun-jie,WANGZe-yu,HANFeng,YANGXiao-yu,SHENGBao-ying

(Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Objective：To explore the neural stem cells (NSCs) transplantation on Aβ1-42induced effects of learning and memory ability and hippocampus synaptophysin I expression in alzheimer's disease rat.Methods：A β1-42 injection method was used to establish rat hippocampus in Alzheimer's disease (AD) rat animal model. Rat’ learning memory ability was tested by Y maze mehod. The I expression in hippocampus tissue of rats was detected by the technology of blot Western.Results：In AD model group, cell transplantation study group, rats’ memory ability and the protein expression of Synapsin I in hippocampus were low compared with the control group (P<0.05).Incelltransplantationstudygroup,rats’memoryabilityandtheproteinexpressionofSynapsinIinhippocampuswerehighcomparedwiththeADmodelgroup(P<0.05). Conclusion: NSCs could significantly improve the learning and memory ability of AD rats, which may be related to the upregulation of the expression of synapsin I.

neural stem cells; transplantation; alzheimer’s disease; synapsin I

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：12531698；黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目，編號(hào)：2012TD013；佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新基金，編號(hào)：LZR2014_018。

杜紅蕾(1988～)女，黑龍江鐵力人，在讀碩士研究生。

盛寶英(1964～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: shengbaoying123@163.com。

R338.1；R742.8+

A

1008-0104(2015)03-0001-03

2015-02-03)