田桂芝，李紹明，王大超，侯立白 (沈陽工學(xué)院，遼寧撫順113122)

板栗(Castanea mollissima Blume)屬殼斗科(Fagceae)栗屬喬木類經(jīng)濟(jì)植物，是世界著名的干果之一［1］。主要分布于北半球溫帶及亞熱帶，在我國大部分地區(qū)均有分布，以華北和長江流域各地栽培集中。我國板栗年總產(chǎn)量達(dá)82．5萬t，占世界總產(chǎn)量的75%［2］。據(jù)《中藥大辭典》［3］記載，板栗具有健脾益氣、補(bǔ)腎強(qiáng)筋、散結(jié)解毒等功效，能治療丹毒、腫瘤等疾病，就連板栗殼也具有止咳、化痰、清熱、去火的作用，常用于藥物治療。板栗之所以具有上述功能，主要是由于板栗中存在多酚物質(zhì)。近年來大量研究表明，多酚類化合物具有抗腫瘤［4］、抗病毒、抑菌、抗氧化［5－6］、防衰老等作用［7－8］而被廣泛應(yīng)用。植物多酚在自然界的儲量非常豐富，其作為一類具有生物活性的天然化合物，對人的身體健康有著重要的影響。而隨著研究的深入，植物多酚在醫(yī)學(xué)、食品、制革工業(yè)、日用化工等方面的應(yīng)用越來越廣泛，用量越來越大，僅靠原有的多酚資源已明顯不足。而板栗恰恰是含有多酚類的植物之一，因此，有必要對板栗資源進(jìn)行開發(fā)和再利用。特別是板栗總苞作為一種廢棄物，對它的開發(fā)和利用將具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效應(yīng)。

目前，對板栗總苞多酚的分析、測定還未見完整的資料報道。盡管資料顯示，常規(guī)測定植物多酚含量的方法很多，但多數(shù)都是用顯色法，如高錳酸鉀法［9］、酒石酸亞鐵法［10］、普魯士蘭法［11］等，但是高錳酸鉀法具有誤差大、操作繁瑣等缺點，酒石酸亞鐵法對測定兒茶素類物質(zhì)具有專屬性，普魯士蘭法在測定多酚時具有數(shù)據(jù)不穩(wěn)定、誤差大等缺點［12］，而Folin-Ciocalteu比色法是植物多酚類化合物常用的測定方法。但由于植物多酚因來源不同，必定會導(dǎo)致分析條件不同［13－15］。因此，對于越來越多的板栗總苞廢棄物，有必要探索一個簡單、科學(xué)、準(zhǔn)確的分析多酚的方法，使其得到充分的再利用。筆者采用Folin-Ciocalteu比色法測定板栗總苞中多酚含量，并對碳酸鈉、Folin-Ciocalteu試劑用量及顯色溫度、顯色時間進(jìn)行優(yōu)化，建立了測定板栗總苞中多酚含量的方法，為板栗總苞綜合開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 原料與試劑。板栗總苞，丹東某地收集;沒食子酸(99%)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;福林－酚(Folin-Ciocalteu)試劑，自制;無水乙醇、碳酸鈉，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1．1．2 主要儀器設(shè)備。數(shù)控超聲波清洗機(jī)，濟(jì)寧欣鑫超聲電子設(shè)備有限公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;HHS-1S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海宜昌儀器紗篩廠;721G型可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;ESJ-4B型電子天平，沈陽龍騰電子有限公司;FW-100型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;80目標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司;ZDHW型調(diào)溫電熱套，北京中興偉業(yè)儀器有限公司;ZGX-9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司。

1．2 分析方法

1．2．1 溶液及試劑的制備。

1．2．1．1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。準(zhǔn)確稱取0．100 0 g沒食子酸，用蒸餾水溶解并定容至100 ml容量瓶中，即得到質(zhì)量濃度為1．000 mg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1．2．2 分析條件的確定。福林酚法的分析原理:在堿性溶液中鎢鉬酸鹽可以將多酚等還原性物質(zhì)定量氧化，而本身被還原(使W6+變?yōu)閃5+)生成藍(lán)色的化合物，藍(lán)色的深淺程度與多酚含量成正比。

1．2．2．1 最佳波長的確定。各取0．50 ml沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和板栗總苞提取液，分別置于25 ml比色管中，依次加入5．0 ml水、2．0 ml福林酚試劑，1 min 后加入 5．0 ml 15%的Na2CO3溶液，定容后于室溫反應(yīng)1．5 h，然后用可見分光光度計在400～900 nm范圍內(nèi)掃描，從而確定最佳波長。

1．2．2．2 福林－酚加入量的確定。取8只25 ml比色管分別加入0．50 ml板栗總苞提取液、5 ml水、不同體積(0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0 ml)的福林 － 酚試劑，1 min后加入8 ml 15%的Na2CO3溶液，然后定容。室溫下反應(yīng)1.5 h后，在確定的最佳波長下測量各樣品的吸光度(A)，以確定福林－酚試劑的最佳加入量。

1．2．2．3 碳酸鈉溶液加入量的確定。取10只25 ml比色管，各加入 0．50 ml板栗總苞提取液、5．0 ml水、3．0 ml福林－酚試劑，1 min 后分別加入 1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0 ml 15%的 Na2CO3溶液，定容后于室溫下反應(yīng)1．5 h，在確定的最佳波長下測定吸光度，以確定碳酸鈉的最佳加入量。

1．2．2．4 反應(yīng)時間的確定。取板栗總苞提取液0．50 ml于25 ml比色管中，加入5．0 ml水、3．0 ml福林 － 酚試劑，1 min后加入6．0 ml 15%的Na2CO3溶液，定容后每隔10 min在確定的最佳波長下測定吸光度1次，以確定最佳反應(yīng)時間。

1．2．2．5 反應(yīng)溫度的確定。取7份0．50 ml板栗提取液于25 ml比色管中，分別加入5．0 ml水、3．0 ml福林 － 酚試劑，1 min后加入6．0 ml 15%的Na2CO3溶液，定容后，分別在25、30、35、40、45、50、55 ℃反應(yīng) 70 min 后，在確定的最佳波長下測定吸光度，以確定最佳反應(yīng)溫度。

考古學(xué)發(fā)現(xiàn)的諸多史前遺存，由于分布地域不同，時代不同，為了準(zhǔn)確的描述和研究它們，需要給遺址進(jìn)行準(zhǔn)確嚴(yán)格的命名，這樣就確立了考古學(xué)文化。

1．2．3 板栗總苞中多酚含量的測定。

1．2．3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。分別取濃度為50μg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0．50、1．00、1．50、2．50、3．50、4．50 ml于 7 支25 ml比色管中，加入5．0 ml水、3．0 ml福林 － 酚試劑，1 min后加入6．0 ml 15%的Na2CO3溶液，定容后在40℃條件下，反應(yīng)70 min。冷卻至室溫后在確定的最佳波長下測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．3．2 板栗總苞提取液中多酚含量的測定。取板栗總苞多酚提取液 0．40 ml，加 5．0 ml水、3．0 ml福林 － 酚試劑，1 min后加入6．0 ml 15%的Na2CO3溶液，混勻后定容。40℃條件下反應(yīng)70 min，在確定的最佳波長下測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得到的線性方程，計算出板栗總苞中多酚的含量。

1．3 分析方法評價

1．3．1 精密度試驗。取0．40 ml板栗總苞提取液于25 ml比色管中，按“1．2．2”所確定的最佳條件連續(xù)測定5次吸光度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價儀器的精密度。

1．3．2 重復(fù)性試驗。取5份0．40 ml板栗總苞提取液于5支25 ml比色管中，按“1．2．2”所確定的最佳條件依次測定吸光度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價分析方法的精密度。

1．3．3 穩(wěn)定性試驗。取0．40 ml板栗總苞提取液于25 ml比色管中，按“1．2．2”所確定的最佳條件反應(yīng)70 min 后，在3．5 h內(nèi)每隔30 min測定一次吸光度，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價分析方法的穩(wěn)定性。

1．3．4 加標(biāo)回收試驗。取6份0．40 ml板栗總苞提取液于6支 25 ml比色管中，分別加入 0、0．50、1．00、1．50、2．00、2.00 ml沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1．2．2”所確定的最佳條件依次測定吸光度，計算沒食子酸的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價分析方法的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2．1 分析條件的確定

2．1．1 最佳波長的選擇。由圖1可見，沒食子酸和板栗總苞提取液經(jīng)顯色反應(yīng)后的光譜吸收曲線具有相似的形狀，均在760 nm處有最大吸收峰。所以測定板栗總苞多酚含量可以用沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同時760 nm為最佳波長。

2．1．2 福林－酚加入量的確定。由圖2可見，隨著福林－酚加入量的增加，吸光度逐漸增大，說明顯色劑與多酚反應(yīng)的程度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)其加入量達(dá)到3．0 ml時，其吸光值趨于極大，之后變化不明顯，說明此時試液中的多酚已基本反應(yīng)完全。所以選擇福林－酚的最佳用量為3．0 ml。

2．1．3 碳酸鈉溶液加入量的確定。由圖3可見，隨著碳酸鈉溶液加入量的增加，吸光度增大，說明堿性的適宜條件逐漸接近。當(dāng)碳酸鈉溶液加入量為6．0 ml時，其吸光度度達(dá)到最大，之后有所下降。所以15%碳酸鈉的最佳用量為6．0 ml。

2．1．4 反應(yīng)時間的確定。由圖4可見，隨著反應(yīng)時間的增加，其吸光度增大;在1 h之內(nèi)隨時間增加，其吸光度明顯增加，1 h之后增加比較緩慢。當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到70 min以后，吸光度略有增加，但變化不大。從分析速度、分析成本及對分析結(jié)果的影響考慮，選擇70 min為最佳反應(yīng)時間。

2．1．5 反應(yīng)溫度的確定。由圖5可見，隨著溫度的升高，吸光度增大，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時，其吸光度達(dá)到最大。隨后吸光度隨溫度升高而下降。當(dāng)溫度超過45℃時，吸光度明顯下降，說明升高溫度有利于顯色反應(yīng)的發(fā)生，但溫度過高，顯色產(chǎn)物的穩(wěn)定性下降。所以選擇40℃為最佳反應(yīng)溫度。

2．2 板栗總苞多酚含量的測定 測定板栗總苞提取液中多酚含量所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。其線性方程為y=0．135 1x+0．019 0，R2=0．999 3，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度與質(zhì)量濃度在0～9μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該方程可用于板栗總苞提取液中多酚含量的定量計算。

以沒食子酸為對照物，按“1．2．3．2”方法測定板栗總苞中的多酚含量為84．81 mg/g，RSD 為2．1%。

2．3 分析方法的評價

2．3．1 儀器精密度試驗。試驗得出，對樣品進(jìn)行5次測定的吸光度(A)依次為 0．480、0．480、0．479、0．480、0．479。數(shù)據(jù)表明，5次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0．11%，說明儀器的精密度良好。

2．3．2 重復(fù)性試驗。試驗得出，對樣品進(jìn)行5次測定的吸光度(A)依次為 0．480、0．482、0．483、0．480、0．484。數(shù)據(jù)表明，5次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0．37%，說明分析方法的精密度較高。

2．3．3 穩(wěn)定性試驗。試驗得出，測定時間為 0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5 h 時，吸光值(A)依次為 0．479、0．479、0．479、0．480、0．480、0．481、0．482、0．482。數(shù)據(jù)表明，在3．5 h內(nèi)隨著時間的增加，吸光度沒有明顯變化，測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0．13%，說明該分析試液具有良好的穩(wěn)定性。

2．3．4 加標(biāo)回收試驗。表1數(shù)據(jù)表明:用該分析方法對板栗總苞中多酚含量測定時，沒食子酸的加標(biāo)回收率在98．0%～101．0%，平均回收率為99．5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%。結(jié)果表明，該分析方法的準(zhǔn)確度較高，可用于板栗總苞多酚含量的測定。

表1 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

3 結(jié)論

用福林－酚法測定板栗總苞多酚含量時，可以用沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。其最佳測定條件是:取0．50 ml板栗總苞提取液，加入3．0 ml福林 － 酚試劑、6．0 ml 15%的 Na2CO3溶液，在40℃條件下反應(yīng)70 min。測定最佳波長為760 nm。吸光度與多酚含量在0～9μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，該方法的平均加標(biāo)回收率為99．5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%(n=5)。該方法具有精密度高、穩(wěn)定性好、操作簡單、快速、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，可用于板栗總苞多酚含量的測定。

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