賀 江， 龍海波

(湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖與加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德415000)

隨著經(jīng)濟(jì)和社會的發(fā)展，中國水產(chǎn)品的消費(fèi)量逐年上升，與此同時(shí)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在中國環(huán)洞庭湖等地區(qū)已成為農(nóng)民增收的重要途徑。然而，水體中農(nóng)藥殘留等化學(xué)污染物的積累嚴(yán)重制約了中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，建立水體中此類化學(xué)污染物的監(jiān)測技術(shù)，成為水產(chǎn)品安全生產(chǎn)體系中的核心環(huán)節(jié)之一。毒死蜱是目前中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的一種有機(jī)磷殺蟲劑，它的使用使水體中積累毒死蜱農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)增大。中國現(xiàn)行的各級農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)方法多是基于色譜或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，標(biāo)準(zhǔn)方法中的樣品前處理技術(shù)仍以液液萃取技術(shù)為主，其存在操作繁瑣耗時(shí)、有機(jī)溶劑使用量大、難以實(shí)現(xiàn)自動化等不足。

針對傳統(tǒng)樣品前處理技術(shù)的各種不足，建立省時(shí)高效、有機(jī)溶劑耗用量少的樣品前處理新技術(shù)一直是分析化學(xué)領(lǐng)域、食品安全檢測領(lǐng)域的一個熱門研究方向［1］。近年來國內(nèi)外學(xué)者發(fā)展建立起了多種新型樣品前處理技術(shù)，例如固相萃取(Solid-phase extraction，SPE)技術(shù)［2-3］、超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction，SFE)技術(shù)［4-5］、固相微萃取(Solid-phase micro extraction，SPME)技術(shù)［6-7］、懸滴微萃取(Single drop micro extraction，SDME)技術(shù)［8-9］、基于中空纖維的液相微萃取(Hollow fiber-liquid phase micro extraction，HF-LPME)技術(shù)［10］、分散液相微萃取(Dispersive liquid-liquid micro extraction，DLLME)技術(shù)［11-14］等。其中DLLME技術(shù)自建立以來，受到了國內(nèi)外諸多學(xué)者的重視，該技術(shù)集采樣、萃取和濃縮于一體，避免了固相微萃取中可能存在交叉污染的問題，是一種操作簡單、快速、成本低、富集效率高且對環(huán)境友好的樣品前處理新技術(shù)，在對液體樣品進(jìn)行處理時(shí)DLLME技術(shù)的優(yōu)勢尤為顯著。

本研究擬建立水體中毒死蜱的DLLME—HPLC分析檢測技術(shù)，重點(diǎn)對DLLME技術(shù)中萃取劑與分散劑種類的選擇、萃取劑與分散劑用量的確定、樣品鹽濃度及pH等條件進(jìn)行優(yōu)化，使水體中毒死蜱殘留檢測技術(shù)得到改進(jìn)，也可為水體中其他類型化學(xué)污染物的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品(來自中國食品藥品檢定研究院)，四氯化碳、三氯乙烷、二氯甲烷、四氯乙烯、三氯甲烷(分析純，上海化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，乙腈、丙酮、乙醇、甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司生產(chǎn))。

1.2 儀器與設(shè)備

P680高效液相色譜儀(美國戴安公司生產(chǎn))，配可變波長紫外檢測器和自動進(jìn)樣器;Diamonsil ODS色譜柱(250.0 mm×4.6 mm，5μm ODS C18，迪馬科技有限公司生產(chǎn));UV-1750型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津制作所生產(chǎn));TG16-II型高速離心機(jī);渦旋振蕩器;15 ml尖底具塞離心管;帶支架的色譜自動進(jìn)樣瓶內(nèi)插管。

1.3 方法與步驟

1.3.1 毒死蜱HPLC檢測條件的設(shè)定 采用UV-1750型紫外可見分光光度計(jì)對毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長掃描，確定其最佳檢測波長為300 nm。參照文獻(xiàn)［15］，確定毒死蜱液相色譜分析條件如下:流動相為甲醇和水(9∶1，體積比)，流速為 1.0 ml/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量15μl。在該條件下，毒死蜱色譜峰與溶劑峰分離效果較佳，且峰形較好，其保留時(shí)間約為8.3 min(圖1)。

圖1 濃度為1.0μg/ml的毒死蜱液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of 1.0 μg/ml chlorpyrifos

1.3.2 水體中毒死蜱DLLME技術(shù)關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化 用池塘水配制濃度為0.10 mg/L的毒死蜱模擬水樣，用于毒死蜱DLLME條件的優(yōu)化。具體過程如下:將一定體積的萃取劑和分散劑分別加入到15 ml尖底具塞離心管中，輕輕搖勻，然后加入10 ml毒死蜱模擬水樣，輕輕振蕩，萃取劑均勻地分散在水相中，形成水、分散劑和萃取劑的乳濁液體系，室溫放置2 min。然后以3 000 r/min離心2 min，萃取劑沉積在離心管底部，吸取沉積相到帶支架的色譜自動進(jìn)樣瓶內(nèi)，按方法1.3.1所述條件進(jìn)行HPLC分析。試驗(yàn)設(shè)置不同種類和不同用量的萃取劑和分散劑，以及不同鹽濃度和pH的水體樣品進(jìn)行對比試驗(yàn)，以毒死蜱色譜峰面積為指標(biāo)對上述條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 水體中毒死蜱DLLME-HPLC分析技術(shù)的評價(jià) 用池塘水配制系列濃度的毒死蜱模擬水樣，按優(yōu)化的DLLME條件和方法1.3.1所述HPLC條件進(jìn)行分析，建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線用于毒死蜱的定量分析，并以信噪比(S/N)為3所對應(yīng)的水樣毒死蜱濃度為檢出限。用池塘水配制濃度為0.01 mg/L、0.10 mg/L、1.00 mg/L的水體模擬樣品，按相同方法進(jìn)行分析，以模擬樣品分析的回收率評價(jià)方法的準(zhǔn)確度，以回收率的變異系數(shù)評價(jià)方法的精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體中毒死蜱DLLME技術(shù)關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化

圖2 萃取劑種類(a)及萃取劑(三氯甲烷)用量(b)對毒死蜱分散液相微萃取效果的影響(n=3)Fig.2 Effect of extraction agent variety(a)and volume(b)on DLLME of chlorpyrifos(n=3)

2.1.1 萃取劑類型及其用量的優(yōu)化 根據(jù)DLLME技術(shù)原理，選擇萃取劑的主要原則如下:密度必須大于水且不溶于水;對目標(biāo)待測物的溶解能力大;還要有較好的色譜行為，不影響目標(biāo)物的定性和定量分析［11-14］。以1 000μl甲醇作為分散劑，分別考察了四氯化碳(密度1.59 g/ml)、三氯乙烷(密度1.35 g/ml)、二氯甲烷(密度1.33 g/ml)、四氯乙烯(密度1.63 g/ml)、三氯甲烷(密度1.48 g/ml)5種萃取劑(用量均為100μl)對毒死蜱的萃取效果。結(jié)果表明，除二氯甲烷外，其他4種萃取劑都能使毒死蜱得到富集，其中三氯甲烷效果最佳(圖2a)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對三氯甲烷的最佳用量進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，在分散劑體積一定時(shí)，隨著萃取劑體積的增大，毒死蜱的色譜峰面積呈先增大后減小的趨勢，用量為100μl時(shí)對毒死蜱的富集效果最佳(圖2b)。

2.1.2 分散劑類型及其用量的優(yōu)化 根據(jù)DLLME技術(shù)原理，分散劑應(yīng)能完全溶解萃取劑，且易溶于水，分散劑作用是使萃取劑和水樣溶液的接觸面積最大，其在水中的溶解度越大，形成的液滴會越小，與目標(biāo)物接觸面積越大，萃取效率也越高［11-14］。以100μl三氯甲烷作為萃取劑，分別考察了乙腈、丙酮、乙醇和甲醇4種分散劑(用量均為1 000μl)對毒死蜱萃取效果的影響。結(jié)果表明，丙酮本身在300 nm處有較強(qiáng)吸收，不宜選用，其他3種分散劑中甲醇效果最佳(圖3a)。分散劑的體積大小將影響萃取劑在水中的分散程度，從而影響沉積體積的大小，進(jìn)而影響萃取效率。因此，本研究進(jìn)一步對甲醇的最佳用量進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，毒死蜱色譜峰面積隨著分散劑體積的增加而增加，這是由于隨甲醇體積增大，三氯甲烷在水中分散更充分，萃取效率也相對越高;甲醇用量為1 200μl時(shí)萃取效果達(dá)到最佳，進(jìn)一步增大用量則沉積體積下降，影響進(jìn)樣要求，萃取效率也降低(圖3b)。

2.1.3 水體樣品NaCl濃度與pH的優(yōu)化 樣品的NaCl濃度和pH能夠影響DLLME富集效果［14］。本研究以1 200μl甲醇為分散劑，100μl三氯甲烷為萃取劑，進(jìn)一步考察水樣NaCl濃度和pH對毒死蜱萃取效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)在水體樣品中添加0.2% ～20.0%的NaCl時(shí)，DLLME過程受到較大影響，難以獲取到足量的沉積相用于后續(xù)HPLC分析，因此后續(xù)試驗(yàn)中不添加NaCl。當(dāng)水體pH在5～10時(shí)，毒死蜱的富集效果變化較大;在6～8時(shí)富集效果較為穩(wěn)定;pH為7時(shí)毒死蜱的富集效果最佳(圖4)。

圖3 分散劑種類(a)及分散劑(甲醇)用量(b)對毒死蜱分散液相微萃取效果的影響(n=3)Fig.3 Effect of dispersing agent variety(a)and volume(b)on DLLME of chlorpyrifos(n=3)

圖4 水體樣品p H對毒死蜱分散液相微萃取效果的影響(n=3)Fig.4 Effect of pH on DLLME of chlorpyrifos(n=3)

2.2 水體中毒死蜱DLLME-HPLC分析技術(shù)的評價(jià)

評價(jià)所建立的DLLME-HPLC分析技術(shù)對毒死蜱檢測的有效性，進(jìn)一步對該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行了研究。用池塘水配制系列濃度的毒死蜱模擬水樣，按優(yōu)化的DLLME條件和1.3.1所述HPLC條件進(jìn)行分析，得到毒死蜱定量分析的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=113.503 0x+0.516 5，R2=0.999 9(其中y為毒死蜱色譜峰面積，x為水樣中毒死蜱濃度)。逐步稀釋模擬水體樣品，按同樣方法進(jìn)行分析，當(dāng)模擬水樣毒死蜱濃度為0.005 mg/L時(shí)，其峰面積約為基線噪聲的3倍，故確定該方法的最低檢出限為0.005 mg/L。對毒死蜱濃度為0.01 mg/L，0.10 mg/L，1.00 mg/L的水體模擬樣品進(jìn)行5次重復(fù)分析，得其回收率和變異系數(shù)(表1)，添加樣品與空白水樣的色譜圖對比如圖5所示。由表1可知，毒死蜱添加濃度為 0.01～1.00 mg/L時(shí)，添加回收率高于85%，變異系數(shù)低于7.5%，說明所建立的方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

圖5 空白水樣(a)與毒死蜱添加樣品(0.1 mg/L)(b)的色譜圖對比Fig.5 The chromatogram of blank water sample(a)and spiked water sample(b)

3 討論

分散液相微萃取集采樣、萃取和濃縮于一體，是一種新型的樣品前處理技術(shù)，與傳統(tǒng)的萃取方法相比具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低、對環(huán)境友好且回收率高和富集倍數(shù)高等特點(diǎn)，其在痕量分析領(lǐng)域中展現(xiàn)出愈來愈廣闊的應(yīng)用前景。本研究建立了水體中毒死蜱DLLME-HPLC分析檢測方法，其關(guān)鍵參數(shù)為:以100μl三氯甲烷為萃取劑，1 200μl甲醇為分散劑，樣品無需添加NaCl，樣品酸堿度控制在中性為宜。該方法的最低檢測限為0.005 mg/L，其準(zhǔn)確度和精密度均能滿足實(shí)際應(yīng)用的要求。

表1 水體中毒死蜱DLLME-HPLC分析法的添加回收率及變異系數(shù)(n=5)Table 1 Spiked recovery and its coefficient of variation of chlorpyrifos in water by DLLME-HPLC(n=5)

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